用于治疗肌肉萎缩症患者的寡核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及寡核苷酸和包含所述寡核苷酸的药物组合物。该寡核苷酸能结合到来自抗肌萎缩蛋白前体mRNA的第一外显子的区域和相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性，其中所述寡核苷酸适用于所述前体mRNA的所述第一外显子和第二外显子、并且优选两者之间外显子的全部延伸的跳读。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人类遗传学领域，更具体地涉及用于设计单一寡核苷酸的方法，该单一寡核苷酸优选地能够诱导前体mRNA(pre-mRNA)的两个或更多个外显子的跳读(略读，skipping)。本专利技术进一步提供所述寡核苷酸、包含所述寡核苷酸的药物组合物和如本文所确定的所述寡核苷酸的应用。
技术介绍
寡核苷酸在医药中脱颖而出用于治疗遗传疾病如肌肉萎缩症。肌肉萎缩症(Muscular dystrophy，MD)是指特征在于进行性无力和骨骼肌变性的遗传疾病。杜兴氏肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)和贝克氏肌肉萎缩症(Becker muscular dystrophy，BMD)是最常见的儿童期形式的肌肉萎缩症，并且在本文中用于说明本专利技术。DMD是严重的、致命的神经肌肉病症，其导致在12岁以前对轮椅支架的依赖性，并且DMD患者在30岁以前常死于呼吸或心脏衰竭。DMD由DMD基因中的突变引起；主要是移码缺失或一个或多个外显子重复(duplication)，小核苷酸插入或缺失，或由无义点突变引起，其通常导致功能性抗肌萎缩蛋白(肌营养不良蛋白，dystrophin)的缺乏。在过去十年期间，为了恢复DMD转录本的断裂的阅读框，特异性诱导的剪接的修饰已新兴为用于杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)的有希望的治疗(van Ommen G.J.等人，Yokota T.等人，van Deutekom等人，Goemans N.M.等人)。使用序列特异性反义寡核苷酸(AON)，其靶向侧接(侧翼，flank)或含有突变的特定外显子且干扰它的剪接信号，该外显子的跳读可以在DMD前体mRNA的加工过程中被诱导。尽管得到截短的转录本，但恢复了开放阅读框并且引入了蛋白质，其类似于在通常较温和贝克氏肌肉萎缩症患者中发现的那些。AON诱导的外显子跳读提供特定突变，和因此用于DMD患者和特别严重BMD患者的潜在个性化治疗方法。由于大多数突变紧紧环绕DMD基因中的外显子45至55，在其区域中的一个特定外显子的跳读可以用于具有各种突变患者亚群的治疗。外显子51的跳读影响最大的患者亚群(约13％)，包括具有外显子45至50、48至50、50或52的缺失的那些患者。对于一些突变，需要一个以上外显子的跳读恢复开放阅读框。例如，对于具有DMD基因中外显子46至外显子50缺失的DMD患者，仅跳读外显子45和51将是矫正性的。为了治疗这些患者，需要给予两种寡核苷酸、一种靶向外显子45而另一种靶向外显子51。已广泛研究在混合体(cocktail)中或在病毒递送的基因构建体中通过使用AON的组合使两个或更多个连续外显子跳读的可行性(Aartsma-Rus A.等人,2004；Béroud C.等人；Van Vliet L.等人；Yokota T.等人；Goyenvalle A.等人)。多外显子跳读将适用于组合的患者亚群，允许模拟已知与相对温和表型相关的缺失，并且将提供工具来解决DMD基因中热点缺失区域以外的稀有突变。对于开发包含多种寡核苷酸的药物的缺点是其药品监管当局可以把不同序列的寡核苷酸作为不同的药物，每个都需要证明稳定的生产、毒性和临床测试。因此，需要能够诱导至少两个外显子的跳读以促进治疗DMD患者的组合子群的单分子化合物。具体实施方式本专利技术提供用于设计单一寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸能够结合到第一外显子的区域并结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域具有至少50％的同一性。通过所述方法获得的寡核苷酸优选地能够诱导所述前体mRNA的所述第一外显子和所述第二外显子的跳读。优选地，也诱导另外的一个或多个外显子的跳读，其中所述另外的一个或多个外显子优选地位于所述第一和所述第二外显子之间。所得到的所述前体mRNA的转录本(其中所述外显子被跳读)是在框内的(in frame)。寡核苷酸在第一方面，本专利技术涉及寡核苷酸，其能够结合到第一外显子的区域并结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域具有至少50％的同一性。该寡核苷酸优选地能够诱导所述前体mRNA的所述第一和第二外显子的跳读；更优选地诱导另外的一个或多个外显子的跳读，其中所述另外的一个或多个外显子优选地位于所述第一和所述第二外显子之间，并且其中所得转录本是在框内的。外显子跳读干扰发生在真核细胞内的天然剪接过程。在高等真核生物中，细胞的DNA中对于蛋白质的遗传信息被编码在外显子中，其通过内含子序列彼此分离。这些内含子在某些情况下很长。真核生物的转录机制产生包含外显子和内含子的前体mRNA，同时常常已在进行前体mRNA的产生期间，剪接机制在称为剪接的过程期间通过去除内含子并连接存在于前体mRNA中的外显子产生用于蛋白质的实际编码mRNA。能够结合到来自前体mRNA的第一外显子的区域并结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域的本专利技术的寡核苷酸被解释为适合于结合到来自前体mRNA的第一外显子的区域并适合于结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域的寡核苷酸。当以前体mRNA使用时或当与前体mRNA组合使用时，优选地在细胞内，本专利技术的此类寡核苷酸的特征在于它的结合特征(即能够结合)。在此背景下“能够”可由“能”替换。因此，本领域技术人员应当理解，能够结合到第一外显子的区域并能够结合到相同由核苷酸序列所限定前体mRNA内的第二外显子的区域的寡核苷酸在结构上限定所述寡核苷酸，即所述寡核苷酸具有序列，使得它与所述第一外显子的所述区域的序列反向互补并也与相同前体mRNA内所述第二外显子的所述区域的序列反向互补。对于本申请的寡核苷酸所需要的所述第一和/或所述第二外显子的所述区域反向互补的程度可小于100％。如本文进一步所提议的，可以允许一定量的错配或一个或两个缺口。可以使用如后文所说明的本专利技术方法来设计具有与所述第二外显子的所述区域至少50％同一性的第一外显子的区域的核苷酸序列(或具有与所述第一外显子的所述区域至少50％同一性的第二外显子的区域的核苷酸序列)，本专利技术的寡核苷酸能够与其结合。优选的前体mRNA是抗肌萎缩蛋白前体mRNA。抗肌萎缩蛋白前体mRNA的第一和第二外显子的优选组合和所述第一和第二抗肌萎缩蛋白外显子的优选区域限定于表2中。本专利技术的寡核苷酸优选地能够诱导所述抗肌萎缩蛋白前体mRNA的所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反义寡核苷酸，用作用于预防、延缓、改善和/或治疗受试者的疾病的药物，其中所述寡核苷酸能够结合到第一外显子的区域和第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性，其中所述第一外显子和所述第二外显子在所述受试者的相同前体mRNA内，其中所述结合引起所述第一外显子和所述第二外显子的跳读，优选地引起从所述第一外显子开始并且包含存在于所述第一外显子和所述第二外显子之间的一个或多个外显子的多外显子延伸的跳读，并且至多引起在所述第一外显子和所述第二外显子之间的外显子的全部延伸的跳读，和其中获得允许产生功能性或半功能性蛋白质的框内转录本。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.03 EP 12174781.0;2012.07.03 US 61/667,5171.一种反义寡核苷酸，用作用于预防、延缓、改善和/或治疗受试者的
疾病的药物，
其中所述寡核苷酸能够结合到第一外显子的区域和第二外显
子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子
的所述区域至少50％的同一性，
其中所述第一外显子和所述第二外显子在所述受试者的相同
前体mRNA内，
其中所述结合引起所述第一外显子和所述第二外显子的跳读，
优选地引起从所述第一外显子开始并且包含存在于所述第一外显子
和所述第二外显子之间的一个或多个外显子的多外显子延伸的跳
读，并且至多引起在所述第一外显子和所述第二外显子之间的外显
子的全部延伸的跳读，和
其中获得允许产生功能性或半功能性蛋白质的框内转录本。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够诱导所述第一
外显子和所述第二外显子之间的所述外显子的全部延伸的跳读。
3.根据权利要求1或2所述的反义寡核苷酸，其中所述结合能够干扰
所述第一外显子和第二外显子的所述区域中的至少一个剪接调控序
列和/或干扰包含所述前体mRNA中的至少所述第一外显子和/或所
述第二外显子的二级结构。
4.根据权利要求3所述的反义寡核苷酸，其中所述剪接调控序列包括
用于丝氨酸-精氨酸(SR)蛋白质的结合位点、外显子剪接增强子
(ESE)，外显子识别序列(ERS)和/或外显子剪接沉默子(ESS)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸，包含10至40个核
苷酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸，与天然存在的基于
核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸包含
至少一种修饰，更优选地
(a)至少一种碱基修饰，优选地选自2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧
啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、2,6-二氨基嘌呤，
更优选地选自5-甲基嘧啶和2,6-二氨基嘌呤；和/或
(b)至少一种糖修饰，优选地选自2'-O-甲基、2'-O-(2-甲氧基)乙基、
2'-O-脱氧(DNA)、2'-F、吗啉代、桥接核苷酸或BNA，或者所
述寡核苷酸包含桥接核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸(BNA/DNA
混合聚体)二者，所述糖修饰更优选地是2'-O-甲基；和/或
(c)至少一种骨架修饰，优选地选自硫代磷酸酯或二氨基磷酸酯，
所述骨架修饰更优选地是硫代磷酸酯。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸
包含一个或多个结合基团，可选地受保护的，选自由以下组成的组：
肽、蛋白质、糖类、药物、靶向部分、摄取增强部分、溶解性增强
部分、药效学增强部分、药代动力学增强部分、聚合物、乙二醇衍
生物、维生素、脂质、多氟烷基部分、类固醇、胆固醇、荧光部分、
报告分子、放射性标记的部分以及它们的组合，所述结合基团直接
或经由二价或多价接头连接到末端或内部残基。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述第一外显
子和第二外显子选自抗肌萎缩蛋白外显子10、18、30、8、9、11、
13、19、22、23、34、40、42、44、45、47、51、53、55、56、57
或60，并且所述疾病是DMD或BMD。
9.根据权利要求8所述的寡核苷酸，能够诱导抗肌萎缩蛋白外显子10
至18、外显子10至30、外显子10至42、外显子10至47、外显子
10至57、外显子10至60、外显子8至19、外显子9至22、外显
子9至30、外显子11至23、外显子13至30、外显子23至42、外
显子34至53、外显子40至53、外显子44至56、外显子45至51、
外显子45至53、外显子45至55、外显子45至60和/或外显子56
至60的跳读。
10.根据权利要求8或9所述的寡核苷酸，包含如在SEQ ID NO:1679、
1688、1671至1678、1680至1687、1689至1741、或1778至1891
的任一项中所限定的碱基序列，并具有这样的长度：所述长度是由
存在于所述碱基序列中的核苷酸数量限定的，或所述长度比在所述
碱基序列中限定的长度长1、2、3、4或5个核苷酸或短1、2、3、
4或5个核苷酸。
11.根据权利要求10所述的寡核苷酸，包含：
(a)如在SEQ ID NO:1679至1681、1778、1812、1813、1884至1886、
1890或1891的任一项中所限定的并具有25、26、27、28、29
或30个核苷酸的长度的碱基序列；或在SEQ ID NO:1814中所
限定的并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序
列；或
(b)如在SEQ ID NO:1688、1689或1839至1844中所限定的并具有
26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
(c)如在SEQ ID NO:1673或1674中所限定的并具有25、26、27、
28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
(d)如在SEQ ID NO:1675或1676中所限定的并具有21、22、23、
24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；
或
(e)如在SEQ ID NO:1677或1678中所限定的并具有25、26、27、
28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
(f)如在SEQ ID NO:1684至1686的任一项中所限定的并具有21、
22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱
基序列；或
(g)如在SEQ ID NO:1704至1706的任一项中所限定的并具有25、
26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(h)如在SEQ ID NO:1707至1709的任一项中所限定的并具有23、
24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；
或
(i)如在SEQ ID NO:1710、1713至1717的任一项中所限定的并具
有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基
序列或
(j)如在SEQ ID NO:1815至1819的任一项中所限定的并具有22、
23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序
列，或
(k)如在SEQ ID NO:1820、1824的任一项中所限定的并具有20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度
的碱基序列，或
(l)如在SEQ ID NO:1826、1780、1782、1832的任一项中所限定的
并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸
的长度的碱基序列，或
(m)如在SEQ ID NO:1821、1825的任一项中所限定的并具有22、
23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱迪思·克里斯蒂娜·西奥多拉·范多伊特科姆，
申请(专利权)人：普罗森萨科技有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL