一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于,所述植物乳杆菌的制备方法如下:(1)菌株的分离（2）菌株的纯化（3）抑酵母试验（4）菌株的药敏试验（5）菌株的鉴定。本发明专利技术的植物乳杆菌可以产生对多种病原菌和腐败菌具有抑制作用的细菌素，该细菌素具有很好的酸稳定性和热稳定性。通过上述制造的活性成分制造的菌剂对高水分苜蓿青贮时，高水分苜蓿水分含量高达81.7%，青贮时间达到240天；同时提高青贮剂的抑菌效果和降低耐药性借助青贮苜蓿进入食物链而传播的隐患。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微生物添加剂的制备方法，尤其涉及一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆 菌的制备方法。
技术介绍
植物乳杆菌，植物乳杆菌是乳酸菌的一种，最适生长温度为30~35,厌氧或兼性厌 氧，菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适PH 6. 5左右，属于同型发酵乳 酸菌。此菌与别的乳酸菌的区别在于此菌的活菌数比较高，能大量的产酸，使水中的PH值 稳定不升高，而且其产出的酸性物质能降解重金属。由于此菌是厌氧细菌(兼性好氧)，在繁 殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。在养殖中后期，由 于动物的粪便和残饵料增加，会下沉到池塘的底部，并且腐烂，滋生很多病菌，生成大量的 氨氮和亚硝酸盐，使底部偷死现象严重。如果长期使用植物乳酸杆菌，就能很好的抑制底部 粪便和残饵料的腐烂，也就降低了氨氮和亚硝酸盐的增加，大量减少了化工降解素的用量， 使养殖成本降低。 随着养殖业的不断发展以及粮食价格的攀升，开发品质优良、安全价廉的牧草饲 料已成为转变养殖业经济增长方式的内在需求。苜蓿是草食动物优质的饲草，其主要产品 是干草，但这种产品制作时常受到淋雨、落叶、价格昂贵的烘干设备以及消耗大量能源等 问题的困扰，苜蓿青贮不仅可以免受以上困扰，还可减少养分损失以保持青绿饲料的营养 特性。 因此，很多技术公开了苜蓿青贮的方法，但由于苜蓿自身的营养特征和菌落特征 导致现有公开的技术或方法中苜蓿青贮的效果不理想，主要问题在于：一、一部分技术要求 青贮时，，需要苜蓿萎蔫或晾晒至65%以下的含水量，这种含水量的要求将导致面临收获 的雨季苜蓿无法进行青贮；二、苜蓿自身附有大量的酵母菌和少量的乳酸菌，苜蓿在青贮过 程中需要使用繁殖快、抑菌强的乳酸菌添加剂，但添加乳酸菌剂的苜蓿青贮品在饲喂动物 时将进入食物链，降低抗生素抗性的风险，需评价乳酸菌剂的抗生素抗性，即乳酸菌剂对 抗生素的敏感性试验。 鉴于上述苜蓿青贮用乳酸菌添加剂存在的问题以及苜蓿青贮时的特征，现有技术不 能同时完成对高水分含量苜蓿进行青贮，同时提高青贮剂的抑菌效果和降低耐药性借助 青贮苜蓿进入食物链而传播的隐患的问题。
技术实现思路
为解决现有技术中的不足，本专利技术目的在于提供一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成 分的制备方法。本专利技术提供了一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所 述植物乳杆菌的制备方法如下： (1)菌株的分离：收集淤泥的浸出液，按体积比2:10的比例加入到无菌水中混匀，连续 稀释，将各个稀释度的菌液100微升分别涂布在MRS固体培养基中，37°C厌氧培养45h ;挑 取透明圈较大的单菌落，在MRS固体培养基上连续划线4次得到纯的单菌落；挑取单菌落于 没有添加碳酸钙的MRS液体培养基中，观察是否产气，产气菌株为异型发酵乳酸菌，不产 气菌株为同型发酵乳酸菌； (2) 菌株的纯化：接入液体LB培养基中，在14-26°C的条件下振荡培养至指数生长期， 将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，14_26°C振荡培养至稳定期初期，将发 酵液离心，取上清，滤纸过滤，得粗菌液；用截留分子量为12KDa的膜包将粗菌液的体积浓 缩至原来的1/10 ;浓缩后的菌液加硫酸铵至65-70%饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至 85-100%，离心取沉淀，在pH=7的KPB缓冲液透析中放置24h ;将透析后的菌液离心，取上 清液，上样于已用pH=7的KPB缓冲液平衡好的CM-S印harose预装柱，洗脱，收集有活性 的部分，即为植物乳杆菌，_20°C冻存； (3) 抑酵母试验：取出-20°C条件下保存的乳酸菌，取10微升注入MRS固体培养基上 涂布，在温度37°C的条件下培养15h ;用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落，接种于 装有IOmlMRS培养基的20ml试管中，在温度37°C的条件下培养17h，得到活化的乳酸菌；按 1%的接种量，将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的250ml三角瓶中，装液 量为100ml，37°C培养17h，此时，每毫升MRS液体培养基中至少含有0.993 X 101° cfu乳 酸菌；5000转离心5min，收集上清液，获得抑菌物一；将酵母菌于YH)液体培养基中28°C 静止培养48h得到酵母菌培养液；双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌能力； (4) 菌株的药敏试验：制备不同浓度的抗生素滤纸片，培养乳酸菌，采用滤纸片扩散法 测定乳酸菌的药敏性，得到8株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株； (5) 菌株的鉴定：将上述步骤筛选得到的菌株进行生物学特性和16S-23S rDNA间隔区 序列鉴定。 上述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1) 或（3)中MRS液体培养基为：蛋白胨12g，牛肉膏8g，酵母膏6g，L-光胱胺酸盐酸盐0.08 g，柠檬酸氢三铵3g，葡萄糖25g，吐温80mL，乙酸钠6g，维生素 K2 3g，磷酸氢二钾3g，硫酸镁 〇. 8g，碳酸钙12 g，硫酸锰0. 3g，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，pH值6-7 ; 上述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1)或（3) 中MRS固体培养基每升的组分及含量为：MRS液体培养基中加入质量百分比1.5%琼脂粉， pH 值为 6.5，121°C 灭菌 20min。 上述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2) 中的发酵培养基的组成为：酵母粉〇. 3g/L，葡萄糖I. 2g/L，硫酸铵2. 5g/L，磷酸氢二钾 I. 5g/L，氯化钾(λ 8g/L，硫酸亚铁(λ 03g/L，硫酸镁(λ 8g/L，pH=8-9。 上述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所述步骤（3)中双 层琼脂平板打孔法测定是指，将30ml的MRS固体培养基注入直径25cm的培养皿中，冷却 Ih ;取IOmL酵母菌培养液加到150ml冷却至45°C的YPD半固体培养基中，摇勻，并迅速倒在 底层MRS培养基上；在底层MRS培养基的上面、间隔相等距离处放置3个被剪短的Iml移液 器Tip头；该被剪短Tip头的高为lcm，直径为0. 8cm ;冷却注入的YPD半固体培养基，时 间为lh，此时，制成双层培养基；取出Tip头，制成用于放置抑菌物的洞口；取相同浓度 的上述乳酸菌抑菌物一，体积数为150微升，加入其中两孔中；剩余一个作为对照，加入 150微升的灭菌俄水；37°C培养48h，测定和记录乳酸菌对酵母菌的抑菌圈直径； 上述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所述步骤（4)中制备不 同浓度的抗生素滤纸片是指，将链霉素、环丙沙星和庆大霉素均配置成85 Pg/ml、35(^g/ml 和1200Pg/ml的三个浓度梯度，阿莫西林、红霉素和头孢拉定均配置成0. 650 Pg/ml、2〇Pg/ ml和8〇Pg/ml的三个浓度梯度，以滤纸制备直径为0. 8cm的圆形滤纸片，将它们放入上述 抗生素溶液中，得到不同浓度的抗生素滤纸片。 上述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所述步骤（4)中 培养乳酸菌是指，取出_本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于,所述植物乳杆菌的制备方法如下:(1)菌株的分离：收集淤泥的浸出液，按体积比2:10的比例加入到无菌水中混匀，连续稀释,将各个稀释度的菌液100微升分别涂布在MRS固体培养基中,37℃厌氧培养45h；挑取透明圈较大的单菌落，在MRS固体培养基上连续划线4次得到纯的单菌落；挑取单菌落于没有添加碳酸钙的MRS液体培养基中,观察是否产气,产气菌株为异型发酵乳酸菌,不产气菌株为同型发酵乳酸菌；（2）菌株的纯化：接入液体LB 培养基中，在14‑26℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，14‑26℃振荡培养至稳定期初期，将发酵液离心，取上清，滤纸过滤，得粗菌液；用截留分子量为12KDa 的膜包将粗菌液的体积浓缩至原来的1/10 ；浓缩后的菌液加硫酸铵至65‑70％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至85‑100％，离心取沉淀，在pH=7的KPB 缓冲液透析中放置24h；将透析后的菌液离心，取上清液，上样于已用pH=7 的KPB 缓冲液平衡好的CM‑Sepharose 预装柱，洗脱，收集有活性的部分，即为植物乳杆菌,‑20℃冻存；（3）抑酵母试验：取出‑20℃条件下保存的乳酸菌,取10微升注入MRS固体培养基上涂布, 在温度37℃的条件下培养15h；用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接种于装有10mlMRS培养基的20ml试管中,在温度37℃的条件下培养17h，得到活化的乳酸菌；按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的250ml三角瓶中,装液量为100ml，37℃培养17h,此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有0.993 × 1010 cfu乳酸菌；5000转离心5min,收集上清液,获得抑菌物一；将酵母菌于YPD液体培养基中28℃静止培养48h得到酵母菌培养液；双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌能力； （4）菌株的药敏试验：制备不同浓度的抗生素滤纸片，培养乳酸菌，采用滤纸片扩散法测定乳酸菌的药敏性，得到8株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株；（5）菌株的鉴定：将上述步骤筛选得到的菌株进行生物学特性和16S‑23S rDNA间隔区序列鉴定。...

【技术特征摘要】
1. 一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌的制备方 法如下： (1) 菌株的分离：收集淤泥的浸出液，按体积比2:10的比例加入到无菌水中混匀，连续 稀释，将各个稀释度的菌液1〇〇微升分别涂布在MRS固体培养基中，37°C厌氧培养45h ;挑 取透明圈较大的单菌落，在MRS固体培养基上连续划线4次得到纯的单菌落；挑取单菌落于 没有添加碳酸钙的MRS液体培养基中，观察是否产气，产气菌株为异型发酵乳酸菌，不产 气菌株为同型发酵乳酸菌； (2) 菌株的纯化：接入液体LB培养基中，在14-26°C的条件下振荡培养至指数生长期， 将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，14_26°C振荡培养至稳定期初期，将发 酵液离心，取上清，滤纸过滤，得粗菌液；用截留分子量为12KDa的膜包将粗菌液的体积浓 缩至原来的1/10 ;浓缩后的菌液加硫酸铵至65-70%饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至 85-100%，离心取沉淀，在pH=7的KPB缓冲液透析中放置24h ;将透析后的菌液离心，取上 清液，上样于已用pH=7的KPB缓冲液平衡好的CM-S印harose预装柱，洗脱，收集有活性 的部分，即为植物乳杆菌，_20°C冻存； (3) 抑酵母试验：取出-20°C条件下保存的乳酸菌，取10微升注入MRS固体培养基上 涂布，在温度37°C的条件下培养15h ;用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落，接种于 装有lOmlMRS培养基的20ml试管中，在温度37°C的条件下培养17h，得到活化的乳酸菌；按 1%的接种量，将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的250ml三角瓶中，装液 量为100ml，37°C培养17h，此时，每毫升MRS液体培养基中至少含有0.993 X 101° cfu乳 酸菌；5000转离心5min，收集上清液，获得抑菌物一；将酵母菌于YH)液体培养基中28°C 静止培养48h得到酵母菌培养液；双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌能力； (4) 菌株的药敏试验：制备不同浓度的抗生素滤纸片，培养乳酸菌，采用滤纸片扩散法 测定乳酸菌的药敏性，得到8株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株； (5) 菌株的鉴定：将上述步骤筛选得到的菌株进行生物学特性和16S-23S rDNA间隔区 序列鉴定。2. 根据权利要求1所述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所 述的步骤（1)或（3)中MRS液体培养基为：蛋白胨12g，牛肉膏8g，酵母膏6g，L-光胱胺酸 盐酸盐0. 08 g，柠檬酸氢三铵3g，葡萄糖25g，吐温80mL，乙酸钠6g，维生素 K2 3g，磷酸氢 二钾3g，硫酸镁0? 8g，碳酸钙12 g，硫酸锰0? 3g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值6-7。3. 根据权利要求1所述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所 述的步骤（1)或（3)中MRS固体培养基每升的组分及含量为：MRS液体培养基中加入质量 百分比1.5%琼脂粉，pH值为6. 5，121 °C灭菌20min。4. 根据权利要求1所述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所 述的步骤（2)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋波，
申请(专利权)人：青岛蓝农谷农产品研究开发有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37