用于分析物的检测和测量的方法和装置制造方法及图纸

描述了用于具有在其上功能化的、对于靶标实体特异的至少一种适体的感应器，制备和使用该感应器的方法，用于糖基化的蛋白质监测和/或生物标志物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关应用的交叉引用本专利技术要求2012年1月31日提交的美国临时申请号61,593,054的权益，其全部公开通过引用并入本文。关于联邦政府赞助研究的声明本专利技术不是在任何政府的支持下完成，并且政府对本专利技术没有权利。序列表本专利技术包含已通过EFS-web提交的序列表，并通过引用将其整体并入本文。ASCII拷贝创建于2013年1月31日，名为420_53354_SEQ_LIST_D2012-15.txt，大小为3,888字节。
和工业实用性本专利技术涉及适体功能化的表面等离子共振(SPR)感应器、制造和使用所述感应器的方法。背景下面的描述提供了本公开相关信息的概述，而并不是承认本文所提供信息或引用的出版物是对于本专利技术的现有技术。血液蛋白的直接检测可有益于多种科学和临床应用，如用于监测糖尿病中特定蛋白质糖基化比例、药物研究和环境监测的生物标记物、癌症诊断和治疗等等。当前对血液蛋白的临床和实验室测量技术为硼酸盐亲和免疫测定、高性能液相色谱法(HPLC)、基于质谱和毛细管的系统，其耗时且成本高昂。更有效和快速响应的测量方法可以大大有益于并提高相关的应用领域，特别是用于开发下一代能实时分析的便携式手持诊断装置。最近对几种基于光学的诊断技术，如近红外光谱法、偏振测量法、光学相干断层成像术、表面等离子共振(SPR)、拉曼和荧光光谱法进行研究来监测血液成分。然而由于所研究样本中存在混杂物质的影响而限制许多这些光学方法的有效性。一种用于体外筛选能高特异性结合靶标分子的核苷酸分子的方法通常被称为SELEX(通过指数扩增的配体系统进化)，其描述于题为“核苷酸配体”的美国专利号5,475,096和题为“核苷酸配体”的美国专利号5,270,163中，所述每个专利特通过引用并入本文。尽管目前使用的SELEX处理过程是有用的，但一直都需要改进的处理过程，其允许筛选更有选择性的适体由体外筛选技术产生。专利技术简述在一个广泛的方面，本文提供了用于检测靶标实体存在的感应器，其包括具有连接到基质的氨基末端或类似的适体探针，其中当感应器被能量源激发：i)在缺乏靶标实体与适体探针之间的特异相互作用时，发出基准信号；或者ii)在存在靶标实体与适体探针之间的特异相互作用时，发出检测信号，其中的基准信号与检测信号不同，由此检测到靶标实体的选择性存在。在特定实施方案中，适体探针包括与靶标实体特异性相互作用的核苷酸序列。在特定实施方案中，靶标实体是如下的一种或多种：大生物分子、小生物分子、有机分子、小分子、核酸、金属离子、蛋白质、酶、肽、药物、染料、癌细胞、病毒、激素或微生物。在特定实施方案中，所述蛋白质是血液蛋白。在特定实施方案中，所述适体探针包括适体和附着的氨基部分。在特定实施方案中，所述适体探针包括在基质和氨基部分之间的SAM连接子。在特定实施方案中，所述带氨基末端的适体探针通过3-巯基丙酸(MPA)连接到基质。在特定实施方案中，所述感应器具有基于连接子特性的能检测pM-nM的可调检测范围。在广泛的方面，本文提供一种用于检测靶标实体是否存在于样品中的方法，其包括：i)样品与本文描述的感应器接触；ii)用能量源激发感应器；和iii)确定发出信号的强度，由此确定靶标实体是否存在于样品中。在特定实施方案中，用表面等离子共振(SPR)来测量能力源。在特定实施方案中，所述方法具有小于1分钟的反应时间。在特定实施方案中，所述方法在大约室温下具有小于1分钟的反应时间。在另一个广泛的方面，本文提供用于检测靶标实体的试剂盒，其包括：本文所描述的感应器；和包含感应器的至少一个容器，其中样品可以添加到所述容器中。在另一个广泛的方面，本文提供用于制备感应器的方法，其包括：i)将自组装单层(SAM)连接子固定化到基质上；和ii)将氨基末端适体固定化到SAM连接子上。在另一个广泛的方面，本文提供用于制备感应器的方法；其包括：i)用自组装单层(SAM)连接子来功能化基质；ii)将步骤i)中的功能化的基质暴露于具有氨基部分的组合物，其具有足以使氨基部分固定化到SAM连接子上；iii)将步骤ii)中的氨基功能化的基质暴露于至少一种适体，其足以使适体固定化到氨基部分上；iv)可选地，去除非特异性固定化的适体；和v)将步骤iii)或iv)中带氨基末端的适体功能化的基质暴露于封闭剂，其足以封闭被氨基部分活化的未占用的SAM位点。在特定实施方案中，具有氨基部分的所述组合物缀合到如下的一个或多个：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(N-(3-dimethylamnopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC))。在另一个方面，本文提供使用本文所描述的感应器检测血液蛋白的方法。在另一个方面，本文提供了用于在糖尿病治疗指导的应用中，用于糖基化蛋白的超灵敏和选择性的检测和测量的方法。在一个特定的实施方案中，所述方法包括使用表面等离子共振。在另一个实施方案中，这种功能化方法可应用于其他感应形式，其包括拉曼和荧光光谱法，并可用来进一步提高现有监测技术的性能。在另一方面，本文提供用于优化靶向血液蛋白的特异性糖基化形式的适体的体外筛选的方法。在一个实施方案中，表面功能化方法用于基于靶标特征来优化灵敏度和选择性。在另一方面，本文提供用于进一步减少所研究样本中可能存在的混杂物质的影响的方法。在另一方面，本文提供一种稳健的、低成本并便携的感应平台，其能够实现与现有大型临床仪器相似的性能。另外，整合的平台在能够评估对胰岛素依赖性糖尿病治疗的依顺性的诊断装置中有用。整合的平台考虑到低成本的手持装置可用于医师办公室或家庭环境中。整合的平台也提供对所收集数据的即时分析，因此允许护理者和/或患者评估患者的长期葡萄糖调节的依顺性。在另一个广泛的方面，本文提供用于鉴定靶向明确位点(例如，糖基化蛋白位点)的适体的方法，其包括在至少一轮通过指数扩增的配体系统进化(SELEX)富集实验方案中引入非靶标的候选物(例如非糖基化的候选物)，以及在至少第二轮SELEX实验方案中引入非靶标候选来去除对糖基化和非糖基化蛋白形式都有亲和力的适体候选物。在另一个广泛的方面，本文提供基于靶标和/或适体特征来优本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于优化针对一种或多种分析物的感应器的灵敏度和/或选择性的方法，包括将一种或多种类型的适体连接到具有自组装单层(SAM)连接的基质上，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以在基质上形成功能化的表面，为了基于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振(SPR)、拉曼光谱法、或荧光光谱法中至少一种的灵敏度和选择性来选择所需的连接间距和/或长度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.31 US 61/593,0541.用于优化针对一种或多种分析物的感应器的灵敏度和/或选择
性的方法，包括
将一种或多种类型的适体连接到具有自组装单层(SAM)连接的
基质上，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以在基质上形
成功能化的表面，
为了基于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振(SPR)、
拉曼光谱法、或荧光光谱法中至少一种的灵敏度和选择性来选择所需
的连接间距和/或长度。
2.权利要求1的方法，其中所述SAM连接的至少一种堆积密度
和/或长度影响表面等离子共振(SPR)信号。
3.权利要求1的方法，其中连接是通过二元SAM和还原解吸附
过程。
4.权利要求3的方法，其中所述解吸附过程包括：将基质的功能
化的表面暴露于抗蛋白质吸附的物质来抑制蛋白质在功能化的基质上
的非特异性吸附。
5.权利要求4的方法，其中抗蛋白质吸附的物质包括1-巯基-11-
十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
6.权利要求1的方法，其中所述SAM连接包括巯基化合物，所
述巯基化合物具有能够与适体形成稳定键的羧基部分。
7.权利要求6的方法，其中巯基化合物包括二硫代二-N-琥珀酰
亚胺丙酸盐(DTSP)。
8.权利要求1的方法，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐
(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)形成所
述SAM连接，
其中PEG3防止蛋白质的非特异性吸附，而且
其中在DTSP上的羧基部分与适体形成稳定键合。
9.权利要求1的方法，其中二元的SAM巯基溶液用于所述SAM

\t连接中。
10.权利要求9的方法，其中通过将3-巯基丙酸(MPA)与(1-
巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)的1mM乙醇溶液相混合，
同时保持二元SAM的总浓度为约1mM来制备所述二元的SAM巯基
溶液。
11.权利要求10的方法，其中MPA和PEG3以约20:80、约50:50
或约80:20的比例存在。
12.权利要求10的方法，其进一步包括
通过还原解吸附来清除MPA，完整保留PEG3；和
允许二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)与适体上的氨基基
团键合，而PEG3不形成任何键。
13.权利要求中任一项的方法，其中所述适体包括能被固定化到
3-巯基丙酸(MPA)上的胺修饰的适体。
14.权利要求中任一项的方法，其中所述表面具有在约5nM-约
1000nM范围的最佳动力学。
15.权利要求中任一项的方法，其中所述感应器包括混合长度的
间隔层。
16.权利要求15的方法，其中所述混合长度层包括11-巯基十一
烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)相组合。
17.权利要求中任一项的方法，其中使用水溶的包含巯基的氨基
酸形成SAM连接，所述氨基酸能直接结合到基质的表面。
18.权利要求17的方法，其中所述氨基酸包括半胱氨酸。
19.用于形成针对一种或多种分析物的感应器的方法，包括：
a)在基质上吸附由3-巯基丙酸(MPA)和(1-巯基-11-十一烷基)
三(乙二醇)(PEG3)构成的二元组件；
b)从步骤a)的基质上还原解吸附MPA；
c)在步骤b)的基质上形成二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐
(DTSP)层；
d)在步骤c)的基质上固定化至少一种类型的适体；并且，
e)将未结合的适体从步骤d)的基质上的PEG3中去除，由此留
下附着在基质的DTSP层上的适体。
20.用于形成针对一种或多种分析物的感应器方法，包括：
a)在乙醇溶液中在金表面基质上吸附由3-巯基丙酸(MPA)和
(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)构成的二元组件；
b)在0.5M KOH溶液中从步骤a)的基质上还原解吸附MPA，
其中通过对溶液施加30分钟-1.2V的电势而选择性地还原在MPA和
PEG3的相分离的二元自组装单层(SAM)中所吸附的MPA；
c)将其上具有PEG3层的步骤b)的基质浸入1mM DTSP溶液
中，以在其上形成DTSP层；
d)在步骤c)的基质上固定化至少一种类型的适体；并且
e)将适体从步骤d)的基质上的PEG3中去除，由此留下附着在
基质的DTSP层上的适体。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述基质具有金表面。
22.前述权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括血液中
蛋白质的糖基化形式。
23.权利要求22的方法，其包括确定总血清蛋白水平中的一部分
特定糖基化蛋白。
24.权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括如下的一种
或多种：人血红蛋白、白蛋白包括人血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋
白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、纤维蛋白原和/或其片段，所述
分析物是非糖基化或糖基化形式。
25.权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括至少第一种
分析物，其具有与至少第二种分析物不同的半衰期，并且所述方法进
一步包括量化第一种和第二种分析物来提供关于在一个或多个时间段
中第一种和第二种分析物的水平的回顾性判断。
26.权利要求25的方法，其中第一种分析物包括血红蛋白并且第
二种分析物包括免疫球蛋白M(IgM)；并且，其中第一种分析物或
第二种分析物以糖基化形式或非糖基化形式存在。
27.权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括至少第一种
分析物，至少第二种分析物和至少第三种分析物，第一种、第二种和
第三种分析物的每一种具有不同的半衰期，所述方法进一步包括：量
化第一种、第二种和第三种分析物以提供关于在一个或多个时间段中
第一种、第二种和第三种分析物的水平的回顾性判断。
28.权利要求27的方法，其中第一种分析物包括血红蛋白，第二
种分析物包括IgM并且第三种分析物包括白蛋白；其中第一种分析
物、第二种分析物或第三种分析物中的一种或多种以糖基化形式或非
糖基化形式存在。
29.权利要求中任一项的方法，用于监测过去的平均血液分析物
水平，所述方法包括：将通过前述权利要求中任一项的方法形成的感
应器与血液样品相接触；确定血液中糖基化形式的分析物的量；和将
血液样品分析物中以糖基化形式存在的分析物的量与给定时间范围的
对照水平相关联。
30.权利要求29的方法，其中所述糖基化形式的蛋白的量是用表
面等离子共振(SPR)来确定。
31.感应器，其包括：连接到具有自组装单层(SAM)连接的基
质上的一种或多种类型的适体，所述SAM连接具有所需的连接间距
和/或长度以形成在基质上的功能化的表面，
为了基于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振(SPR)、
拉曼光谱法、或荧光光谱法中至少一种的灵敏度和选择性来选择所需
的连接间距和/或长度。
32.权利要求中任一项的感应器，其中所述SAM连接的至少一种
堆积密度和/或长度影响表面等离子共振(SPR)信号。
33.权利要求中任一项的感应器，其中所述连接是通过二元SAM
和还原解吸附过程。
34.前述权利要求的感应器，其中所述基质的功能化的表面已暴
露于抗蛋白吸附的物质，其足以抑制蛋白质在功能化的表面上的非特
异性吸附。
35.前述权利要求的感应器，其中抗蛋白质吸附的物质包括1-巯
基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
36.权利要求中任一项的感应器，其中所述SAM连接包括具有能
够与适体形成稳定键的羧基部分的巯基化合物。
37.前述权利要求的感应器，其中所述巯基化合物包括二硫代二
-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)。
38.权利要求中任一项的感应器，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚
胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)
形成所述SAM连接，
其中PEG3防止蛋白质的非特异性吸附，而且
其中在DTSP上的羧基部分与适体形成稳定键合。
39.权利要求中任一项的感应器，其中二元的SAM巯基溶液用于
所述SAM连接中。
40.前述权利要求的感应器，其中通过将3-巯基丙酸(MPA)与
(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)的1mM乙醇溶液相
混合，同时保持二元SAM的总浓度为约1mM来制备所述二元的SAM
巯基溶液。
41.前述权利要求的感应器，其中MPA和PEG3以约20:80、约
50:50或约80:20的比例存在。
42.权利要求中任一项的感应器，其中通过还原解吸附清除
MPA，完整保留PEG3；和二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)
与适体上的氨基基团共价结合，并且PEG3不形成任何键。
43.权利要求中任一项的感应器，其中所述适体包括能被固定化
到3-巯基丙酸(MPA)上的胺修饰的适体。
44.权利要求中任一项的感应器，其中所述表面具有在约5nM-
约1000nM范围的最佳动力学。
45.权利要求中任一项的感应器，其中所述感应器包括混合长度
的间隔层。
46.前述权利要求的感应器，其中所述混合长度层包括11-巯基十

\t一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)相组合。
47.权利要求中任一项的感应器，其中所述SAM连接包括水溶
的包含巯基的氨基酸，其能直接结合到基质的表面。
48.前述权利要求的感应器，其中所述氨基酸包括半胱氨酸。
49.权利要求中任一项的感应器，其中基质的至少表面是金的。
50.权利要求中任一项的感应器，其配置为感应包括血液中蛋白
质的糖基化形式的分析物。
51.前述权利要求的感应器，其配置为从总血清蛋白水平中确定
一部分特定的糖基化蛋白。
52.权利要求中任一项的感应器，其中所述分析物包括如下的一
种或多种：人血红蛋白、白蛋白包括人血清白蛋白(HSA)、免疫球
蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、纤维蛋白原和/或其片段，所
述分析物为糖基化或非糖基化形式。
53.权利要求中任一项的感应器，其中分析物包括至少第一种分
析物，其具有与至少第二种分析物不同的半衰期。
54.前述权利要求的感应器，其中第一种分析物包括血红蛋白并
且第二种分析物包括免疫球蛋白M(IgM)；并且，其中第一种分析
物或第二种分析物以糖基化形式或非糖基化形式存在。
55.权利要求中任一项的感应器，其中所述分析物包括至少第一
种分析物，至少第二种分析物和至少第三种分析物，第一种、第二种
和第三种分析物的每一种具有不同的半衰期。
56.前述权利要求的感应器，其中第一种分析物包括血红蛋白，
第二种分析物包括IgM并且第三种分析物包括白蛋白；其中第一种分
析物、第二种分析物或第三种分析物的一种或多种是以糖基化形式或
非糖基化形式存在。
57.权利要求中任一项的感应器用于监测过去的平均血液分析物
水平的用途，其通过：将用前述权利要求中任一项的方法形成的感应
器与血液样品相接触；确定血液中分析物的糖基化形式的量；并将血
液样品分析物中以糖基化形式存在的分析物的量与给定时间范围的对

\t照水平相关联。
58.前述权利要求的用途，其中所述蛋白质的糖基化形式的量使
用表面等离子共振(SPR)来确定。
59.权利要求中任一项的感应器，其中所述适体包括能够与特定
的分析物相...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·D·卡梅伦，DS·吉姆，
申请(专利权)人：托莱多大学，
类型：发明
国别省市：美国;US