用于治疗蓬佩氏病的方法和材料技术

本文件涉及具有酸性alpha葡糖苷酶活性和至少一处修饰的分子复合物，所述修饰导致分子复合物被转运到哺乳动物细胞内部的能力增强。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对相关申请的交叉引用本申请要求2012年3月15日提交的美国临时申请流水号61/611,485的权益。认为先前申请的公开内容是本申请的公开内容(并且通过提及并入其中)的一部分。专利
本专利技术涉及具有酸性alpha葡糖苷酶活性的分离的分子复合物，且更具体地涉及包含通过蛋白水解从前体分子衍生的至少两个多肽的分子复合物，其中所述分子复合物包含至少一处修饰，其导致所述分子复合物被转运到哺乳动物细胞内部的能力增强。专利技术背景蓬佩(Pompe)氏病(又称为糖原贮积病(glycogen-storage disease)II型或酸性麦芽糖酶缺陷)是一种罕见的常染色体隐性病症，其由于酸性alpha葡糖苷酶(GAA)缺陷而导致糖原在溶酶体中的积累。糖原的积累引起遍及全身的进行性肌无力(progressive muscle weakness)(肌病)，并且影响各个身体组织，包括心脏、骨骼肌、肝、和神经系统。蓬佩氏病被宽泛地分成婴儿期发作性和迟发性形式。在婴儿期发作性形式中，婴儿通常在婴儿期早期(4-8个月龄)期间呈现无力和懒散(floppiness)，并且不能举起他们的手，而且不能进行对于其年龄而言常见的其他运动任务，诸如翻身。在不治疗的情况下，具有蓬佩氏病的婴儿通常由于心力衰竭(heart failure)和呼吸虚弱(respiratory weakness)而在12个月龄前死亡。参见United Pompe Foundation。迟发性形式(包括青少年和成年形式)比婴儿期形式具有更晚的发作并且更慢地进展。重组人GAA(或)用于治疗蓬佩氏病。然而，或都是非常昂贵的，每年费用完全超过300,000美元。因而，需要改善的蓬佩氏病治疗。专利技术概述在一个方面，本文件的特征在于一种分离的分子复合物，其具有酸性alpha葡糖苷酶(GAA)活性，且包含至少两个多肽(例如至少三个或至少四个多肽)，每个多肽与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85％(例如至少90％、95％、99％、或100％)序列同一性，每个区段通过在氨基酸50和氨基酸74之间(例如氨基酸56和氨基酸68之间或氨基酸60和氨基酸65之间)的一个或多个位点处对SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的蛋白水解衍生。所述分子复合物包含至少一处修饰，其导致所述分子复合物被转运到哺乳动物细胞内部的能力增强。对SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的蛋白水解进一步可以包括在SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之间的一个或多个位点处的切割或在SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的氨基酸137和氨基酸151之间的一个或多个位点处的切割。蛋白水解进一步可以包括在SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之间的一个或多个位点处的切割和在SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的氨基酸137和氨基酸151之间的一个或多个位点处的切割。在本文中描述的任何分子复合物中，至少一个多肽可以包含一个或多个磷酸化的N-聚糖，且所述修饰可以包含至少一个磷酸化的N-聚糖的脱帽(uncapping)和脱甘露糖基化(demannosylation)。至少一个多肽上的至少40％(例如至少60％、80％、90％、95％、或99％)的N-聚糖可以是脱帽且脱甘露糖基化的。在本文中描述的任何分子复合物中，对于所述至少两个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸22至57，且其中对于所述至少两个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸66至896。在含有至少三个多肽的本文中描述的任何分子复合物中，对于所述至少三个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸22至57，其中对于所述至少三个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸66至726，且其中对于所述至少三个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸736至896。在含有至少四个多肽的本文中描述的任何分子复合物中，对于所述至少四个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸22至57，其中对于所述至少四个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸66至143，其中对于所述至少四个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸158至726，且其中对于所述至少四个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸736至896。在本文中描述的任何分子复合物中，所述至少一处修饰可以包括与分子复合物中至少一个多肽融合的下列至少一种：胞外受体的配体，结合靶细胞表面上的受体胞外域的靶向域，尿激酶型纤维蛋白溶酶原受体，或人胰岛素样生长因子II的识别域。本文件的特征还在于包含本文中描述的任何分子复合物的组合物，其中分子复合物是冻干的。所述组合物可以以一次性管形瓶(single use vial)包装。本文件的特征还在于药物组合物，其包含本文中描述的任何分子复合物和药学可接受载体。所述组合物可以被配制用于静脉内或皮下施用。所述组合物可以被配制用于静脉内输注。在另一个方面，本文件的特征在于治疗蓬佩氏病的方法。所述方法包括对诊断为蓬佩氏病的患者施用本文中描述的任何组合物。所述患者可以诊断为婴儿期发作性蓬佩氏病或迟发性蓬佩氏病。本文件的特征还在于生成分子复合物的方法。所述方法包括使与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的多肽与蛋白酶接触，所述蛋白酶与SEQ ID NO:8中所列的氨基酸序列具有至少85％(例如至少90％，至少95％，至少99％，或100％)序列同一性，其中所述蛋白酶在氨基酸50和氨基酸74之间(例如氨基酸56和氨基酸68之间或氨基酸60和氨基酸65之间)的一个或多个位点处切割所述多肽。可以在体外实施接触步骤。本文件的特征还在于用于生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复合物的方法。该方法包括使分子复合物与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶能够(i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸及(ii)水解末端alpha-1,2甘露糖，alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接，所述分子复合物具有GAA活性且包含至少两个多肽，每个多肽与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85％序列同一性，每个区段通过在氨基酸50和氨基酸74之间(例如氨基酸56和氨基酸68之间或氨基酸60和氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的分子复合物，其具有酸性alpha葡糖苷酶(GAA)活性，且包含至少两个多肽，每个多肽与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85％序列同一性，每个区段通过对SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位点处的蛋白水解衍生；其中所述分子复合物包含至少一处修饰，其导致所述分子复合物被转运到哺乳动物细胞内部的能力增强。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.15 US 61/611,4851.一种分离的分子复合物，其具有酸性alpha葡糖苷酶(GAA)活性，且包
含至少两个多肽，每个多肽与SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的区段具有
至少85％序列同一性，每个区段通过对SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列在
氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位点处的蛋白水解衍生；其中所述分
子复合物包含至少一处修饰，其导致所述分子复合物被转运到哺乳动物细胞
内部的能力增强。
2.权利要求1的分子复合物，其中每个区段通过对SEQ ID NO:1中所列
的氨基酸序列在氨基酸60和氨基酸65之间的一个或多个位点处的蛋白水解
衍生。
3.权利要求1的分子复合物，所述复合物包含至少三个多肽。
4.权利要求1-3中任一项的分子复合物，其中所述对SEQ ID NO:1中所
列的氨基酸序列的蛋白水解进一步包括在SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序
列的氨基酸719和氨基酸746之间的一个或多个位点处的切割或氨基酸137和
氨基酸151之间的一个或多个位点处的切割。
5.权利要求1-4中任一项的分子复合物，所述复合物包含至少四个多肽。
6.权利要求5的分子复合物，其中所述蛋白水解进一步包括在SEQ ID 
NO:1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之间的一个或多个位点
处的切割和在SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列的氨基酸137和氨基酸151
之间的一个或多个位点处的切割。
7.权利要求1-6中任一项的分子复合物，其中至少一个所述多肽包含一
个或多个磷酸化的N-聚糖，且其中所述修饰包含至少一个磷酸化的N-聚糖的
脱帽和脱甘露糖基化。
8.权利要求5的分子复合物，其中所述多肽上至少40％的N-聚糖是脱帽
且脱甘露糖基化的。
9.权利要求8的分子复合物，其中所述多肽上至少60％的N-聚糖是脱帽
且脱甘露糖基化的。
10.权利要求8的分子复合物，其中所述多肽上至少80％的N-聚糖是脱帽
且脱甘露糖基化的。
11.权利要求8的分子复合物，其中所述多肽上至少90％的N-聚糖是脱帽

\t且脱甘露糖基化的。
12.权利要求1-11中任一项的分子复合物，其中每个多肽与SEQ ID NO:1
中所列的氨基酸序列的区段具有至少90％序列同一性。
13.权利要求1-11中任一项的分子复合物，其中每个多肽与SEQ ID NO:1
中所列的氨基酸序列的区段具有至少95％序列同一性。
14.权利要求1-13中任一项的分子复合物，其中对于所述至少两个多肽
之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸22至57，且其中对于所述至少两
个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸66至896。
15.权利要求3-14中任一项的分子复合物，其中对于所述至少三个多肽
之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸22至57，其中对于所述至少三个
多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸66至726，且其中对于所述至
少三个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸736至896。
16.权利要求5-14中任一项的分子复合物，其中对于所述至少四个多肽
之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸22至57，其中对于所述至少四个
多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸66至143，其中对于所述至少
四个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸158至726，且其中对于
所述至少四个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO:1的氨基酸736至896。
17.权利要求1-16中任一项的分子复合物，其中所述至少一处修饰包括
与至少一个所述多肽融合的胞外受体的配体。
18.权利要求1-16中任一项的分子复合物，其中所述至少一处修饰包括
与至少一个所述多肽融合的靶向域，其中所述靶向域结合靶细胞的表面上的
受体的胞外域。
19.权利要求1-16中任一项的分子复合物，其中所述至少一处修饰包括
与至少一个所述多肽融合的尿激酶型纤维蛋白溶酶原受体。
20.权利要求1-16中任一项的分子复合物，其中所述至少一处修饰包括
与至少一个所述多肽融合的人胰岛素样生长因子II的识别域。
21.一种组合物，其包含权利要求1-20中任一项的分子复合物，其中所
述分子复合物是冻干的。
22.权利要求21的组合物，其中所述组合物以一次性管形瓶包装。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项的分子复合物和药
学可接受载体。
24.权利要求23的组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内或皮下施
用。
25.权利要求23的组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内输注。
26.一种治疗蓬佩(Pompe)氏病的方法，所述方法包括对诊断为蓬佩氏病
的患者施用权利要求23至25中任一项的所述组合物。
27.权利要求26的方法，其中所述患者诊断为婴儿期发作性(infantile 
onset)蓬佩氏病。
28.权利要求26的方法，其中所述患者诊断为迟发性蓬佩氏病。
29.一种用于生成分子复合物的方法，所述方法包括使具有SEQ ID 
NO:1中所列的氨基酸序列的多肽与蛋白酶接触，所述蛋白酶与SEQ ID NO:8
中所列的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，其中所述蛋白酶在氨基酸50
和氨基酸74之间的一个或多个位点处切割所述多肽。
30.权利要求29的方法，其中在体外实施所述接触。
31.权利要求29或权利要求30的方法，其中所述蛋白酶在氨基酸60和氨
基酸65之间的一个或多个位点处切割所述多肽。
32.一种用于生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复
合物的方法，所述方法包括使分子复合物与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷
酶能够(i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸及(ii)水解末端
alpha-1,2甘露糖，alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接，所述分子复合
物具有GAA活性且包含至少两个多肽，每个多肽与SEQ ID NO:1中所列的氨
基酸序列的区段具有至少85％序列同一性，每个区段通过对SEQ ID NO:1中
所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位点处的蛋白
水解衍生，其中至少一个所述多肽包含含有一个或多个甘露糖-1-磷酸-6-甘
露糖模块的磷酸化N-聚糖。
33.权利要求32的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
34.权利要求32或33的方法，其中所述甘露糖苷酶是直生刀豆(Canavalia 
ensiformis)甘露糖苷酶。
35.权利要求32或33的方法，其中所述甘露糖苷酶是解脂耶氏酵母
(Yarrowia lipolytica)甘露糖苷酶。
36.权利要求32-35中任一项的方法，其中在重组真菌细胞中发生所述接
触，所述真菌细胞表达所述甘露糖苷酶。
37.一种生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复合物
的方法，所述方法包括使分子复合物与能够水解末端alpha-1,2甘露糖、
alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接的甘露糖苷酶接触，所述分子复合
物具有GAA活性且包含至少两个多肽，每个多肽与SEQ ID NO:1中所列的氨
基酸序列的区段具有至少85％序列同一性，每个区段通过对SEQ ID NO:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：W沃维肯，KCTAM皮恩斯，JRL斯陶特，GN派纳尔特，
申请(专利权)人：奥克西雷恩英国有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB