本发明专利技术公开了一种复合微生物的连续发酵法，包括以下步骤：1)、分别制备枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和丁酸梭菌菌液；2)、将发酵罐内加入基础发酵液；3)、控制基础发酵液的温度为36～38℃，控制罐压0.01Mpa，先投入枯草芽孢杆菌液发酵培养，再投入地衣芽孢杆菌菌液继续发酵培养，最后投入丁酸梭菌菌液静置厌氧发酵培养；4)、步骤3)所得的发酵液过滤后离心浓缩至原体积的28～32％；然后经喷雾干燥，得复合益生菌制剂。本发明专利技术克服了微生物单独发酵过程中灭菌次数多、进料次数多的缺点，简化发酵程序，同时通过连续发酵中和不同微生物的协同作用，提高活菌数、降低杂菌数，提高了微生物的作用效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵领域，涉及一种复合微生物的发酵工艺——丁酸梭菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的分段连续发酵工艺。
技术介绍
丁酸梭菌是一种厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，由于其严格厌氧，在发酵环境中如有氧气存在，丁酸梭菌菌体将不会生长甚至死亡。丁酸梭菌耐热、耐酸、耐胆汁，且对多种饲用抗生素有较强的耐受性，可配伍使用；可产生淀粉酶，水解淀粉和糖类；产生丁酸、醋酸和乳酸等代谢产物。其在临床上已被广泛应用于治疗消化、小儿等各种原因引起的肠道菌群紊乱、急慢性腹泻、肠应激综合征、抗生素相关性肠炎等各种肠道疾病，且在日本、韩国等地作为饲料添加剂应用于畜禽养殖上也取得了很好的效果，对于减少当前饲料中抗生素产品的滥用、减少药物在肉品中的残留、降低动物细菌的耐药性和保障动物健康方面有着重要的意义，是一种理想的、具有广阔开发前景的微生态制剂。 地衣芽孢杆菌是一种兼性厌氧的微生物，其在有氧无氧条件下均可生长，进入动物胃肠道后在生长繁殖过程中可以消耗肠内氧气，维持肠道厌氧环境，促进肠道有益菌如双歧杆菌和乳酸菌的增殖和发育，防止病原菌及腐败菌在肠道内的异常增殖，从而调节动物肠道微生态平衡。地衣芽孢杆菌能形成孢子，而且能耐高温(100℃)、耐酸碱、耐挤压和耐温度变化等，能满足生产加工特性，在饲料中应用具有良好的生产性能。我国对地衣芽孢杆菌的应用开发起步较晚，因此导致目前市场上虽有一些地衣芽孢杆菌产品，但其有效活菌数低、生产工艺复杂且成本较高，而且产品质量参差不齐，影响了其使用效果。 枯草芽孢杆菌是好氧的微生物，在有氧条件下生长，进入动物胃肠道后能迅速消耗消化道内的游离氧，形成肠道低氧环境，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌的生长。枯草芽孢杆菌菌体能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，在消化道中与内源酶共同发挥作用，提高饲料消化率。同时枯草芽孢杆菌在繁殖过程中能合成多种维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。具有产酶量高、抑菌能力强、安全性好、环保等优点。此外，枯草芽孢杆菌具有耐酸、耐盐、耐高温(100℃)及耐挤压的特性，在饲料加工中保存良好，有利于推广应用。其作为极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。 上述益生菌的单独发酵菌面临的发酵成本高、活菌数低、杂菌多等问题，而国内外对三联发酵技术尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种复合微生物的联系发酵新工艺，克服微生物单独发酵过程中灭菌次数多，进料次数多的缺点，简化发酵程序，降低微生物发酵的生产成本，同时通过连续发酵中和不同微生物的协同作用，提高活菌数、降低杂菌数，提高微生物的作用效果。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种复合微生物的连续发酵法，包括以下步骤： 1)、分别制备枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和丁酸梭菌菌液； 2)、将发酵罐内加入15吨培养基Ⅲ作为基础发酵液； 3)、控制基础发酵液的温度为36～38℃，控制罐压0.01Mpa，投入140～160L的枯草芽孢杆菌液于36～38℃的温度、750～850m3/h的通气量、搅拌条件下发酵培养11～13h(较佳为12h)； 然后，投入140～160L的地衣芽孢杆菌菌液于36～38℃的温度、750～850m3/h的通气量、搅拌条件下继续发酵培养15～17h(较佳为16h)； 接着，停止搅拌和通气，于36～38℃的温度下继续发酵培养2h； 最后，投入140～160L的丁酸梭菌菌液于36～38℃的温度静置厌氧发酵培养23～25h(较佳为24h)； 4)、步骤3)所得的发酵液过滤后离心浓缩至原体积的28～32％；然后经喷雾干燥，得复合益生菌制剂。 作为本专利技术的复合微生物的连续发酵法的改进： 培养基Ⅲ的制备方法为：葡萄糖20g，玉米粉10g，大豆粉40g，酵母粉8g，1g硅油(H201－100)，碳酸氢钙0.5g，氯化钙0.015g，硫酸铵1g，硫酸镁0.15g，硫酸锰0.15g，加水1000ml，用NaHCO3调节pH至7.0，于121-128℃条件下消毒30-35min。 作为本专利技术的复合微生物的连续发酵法的进一步改进： 枯草芽孢杆菌菌液的制备方法为： 将3.0ml的浓度为50×108cfu/ml的枯草芽孢杆菌(保藏号：CGMCC No.9383)菌液接种于1.9～2.1L的培养基Ⅰ中，于36～38℃摇床培养17～19h(较佳为18h)，然后投入280～320L的培养基Ⅲ于36～38℃、9～11m3/h的通气量、搅拌条件下扩大培养培养17～19h(较佳为18h)；得枯草芽孢杆菌菌液； 地衣芽孢杆菌菌液的制备方法为： 将3.0ml的浓度为50×108cfu/ml的地衣芽孢杆菌(保藏号：CGMCC No.9385)菌液接种于1.9～2.1L的培养基Ⅰ中，于36～38℃摇床培养17～19h(较佳为18h)，然后投入280～320L的培养基Ⅲ于36～38℃、9～11m3/h的通气量、搅拌条件下扩大培养17～19h(较佳为18h)；得地衣芽孢杆菌菌液； 丁酸梭菌菌液的制备方法为： 将3.0ml的浓度为2.0×108cfu/ml的丁酸梭菌(保藏号：CGMCC No.9386)菌液接种于1.9～2.1L的培养基Ⅱ中，于36～38℃静置厌氧培养17～19h(较佳为18h)，然后投入280～320L的培养基Ⅲ于36～38℃静置厌氧扩大培养17～19h(较佳为18h)，得丁酸梭菌菌液； 所述培养基Ⅰ为牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，所述培养基Ⅱ为RCM培养基。备注说明：这2种培养基为常规培养基。 作为本专利技术的复合微生物的连续发酵法的进一步改进： 所述步骤4)中的过滤为经100目过滤；喷雾干燥的进风温度210℃±5℃、出风口温度95℃±5℃。 本专利技术还同时提供了利用上述任一方法制备而得的复合益生菌制剂(即，复合菌剂)。 本专利技术制得的产品(复合益生菌制剂)中枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌和丁酸酸菌含量分别约为1.5×109cfu/g、1.8×109cfu/g、1.2×107cfu/g。总菌数约为3.3×109cfu/g。 备注说明，本专利技术所涉及的3种菌株的保藏信息具体如下： 枯草芽孢杆菌菌株HJBA058，保藏名称为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCC No.9383，保藏日期：2014年06月25日。 地衣芽孢杆菌菌株HJBL008，保藏名称为：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCC No.9385，保藏日期：2014年06月25日。 <本文档来自技高网...
【技术保护点】
复合微生物的连续发酵法，其特征是包括以下步骤：1)、分别制备枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和丁酸梭菌菌液；2)、将发酵罐内加入15吨培养基Ⅲ作为基础发酵液；3)、控制基础发酵液的温度为36～38℃，控制罐压0.01Mpa，投入140～160L的枯草芽孢杆菌液于36～38℃的温度、750～850m3/h的通气量、搅拌条件下发酵培养11～13h；然后，投入140～160L的地衣芽孢杆菌菌液于36～38℃的温度、750～850m3/h的通气量、搅拌条件下继续发酵培养15～17h；接着，停止搅拌和通气，于36～38℃的温度下继续发酵培养2h；最后，投入140～160L的丁酸梭菌菌液于36～38℃的温度静置厌氧发酵培养23～25h；4)、步骤3)所得的发酵液过滤后离心浓缩至原体积的28～32％；然后经喷雾干燥，得复合益生菌制剂。
【技术特征摘要】
1.复合微生物的连续发酵法，其特征是包括以下步骤：
1)、分别制备枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液和丁酸梭菌菌液；
2)、将发酵罐内加入15吨培养基Ⅲ作为基础发酵液；
3)、控制基础发酵液的温度为36～38℃，控制罐压0.01Mpa，投入140～160L的枯草芽孢
杆菌液于36～38℃的温度、750～850m3/h的通气量、搅拌条件下发酵培养11～13h；
然后，投入140～160L的地衣芽孢杆菌菌液于36～38℃的温度、750～850m3/h的通气量、搅
拌条件下继续发酵培养15～17h；
接着，停止搅拌和通气，于36～38℃的温度下继续发酵培养2h；
最后，投入140～160L的丁酸梭菌菌液于36～38℃的温度静置厌氧发酵培养23～25h；
4)、步骤3)所得的发酵液过滤后离心浓缩至原体积的28～32％；然后经喷雾干燥，得
复合益生菌制剂。
2.根据权利要求1所述的复合微生物的连续发酵法，其特征是：
培养基Ⅲ的制备方法为：葡萄糖20g，玉米粉10g，大豆粉40g，酵母粉8g，1g硅油，碳
酸氢钙0.5g，氯化钙0.015g，硫酸铵1g，硫酸镁0.15g，硫酸锰0.15g，加水1000ml，用NaHCO3调节pH至7.0，于121-128℃条件下消毒30-35min。
3.根据权利要求2所述的复合微生物的连续发酵法，其特征是：
枯草芽孢杆菌菌液的制备方法为：
将3.0ml的浓度为50×10...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘金松，曾新福，杨彩梅，汪以真，冯杰，
申请(专利权)人：浙江惠嘉生物科技有限公司，浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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