用于表面增强共振拉曼光谱法的染料组制造技术

本发明专利技术了涉及在多通道分析中使用的试剂盒，所述试剂盒包含主要由多种染料组成的一组染料和每一种染料与标准浓度的相关性。所述一组染料已经被选择为使得：使用表面增强共振拉曼光谱法，所述一组染料中的每一种染料在所述一组染料中的任意另一种染料存在的情况下在这两种染料中的每一种染料的0.6至1.5的对应染料标准浓度的整个浓度范围内可以以优于90％的灵敏度和90％的特异性进行识别。在一个实施方式中，所述一组染料由如下染料组成：JOE、若丹明绿、ATTO520、BODIPY FL、BODIPY TMR-X、FAM、HEM、Cy3、Cy3.5、TAMRA和TYE563。本发明专利技术还涉及包括所述一组染料的多通道分析、用于进行所述多通道分析的设备以及选择所述一组染料的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表面增强共振拉曼光谱法的染料组
本专利技术涉及在多通道分析（multiplex assay)使用的染料组以及选择所述染料组 的方法，其中所述染料使用表面增强共振拉曼光谱法（surface enhanced resonant Raman spectroscopy, SERRS)进行识别。本专利技术还涉及多通道分析和用于实施所述多通道分析的 设备。
技术介绍
在实验室环境中的多通道技术（multiplexing)被定义为在单个探询 (interrogation)中同时对多个分析物进行的检测。一般而言，优点是生成了多得多的数据 点并且能够聚集（gather)较高程度的信息。这可以导致时间的大量减少，该时间的大量减 少可以通过在单次检验（test)中搜索多个标靶来实现，而不是实施多个系列分析。高通量 的多通道分析意味着容易方便进行大规模检验。另外，全组（full panel)检验所需的样品 的物理体积显著降低一这在样品难以获得和/或仅能以少量获得的情况下可能是重要的。 这造成的冲击效应（knock-on effect)是实验室消耗品和人力资源的量也显著降低，意味 着运行成本和废物的减少。 有很多技术可以用来检测多个分析物。最常用的技术之一是荧光法，其中感兴趣 的分析物是荧光性的或者感兴趣的分析物标记有荧光染料。使用荧光法作为检测技术有若 干种缺点。主要问题是缺乏唯一可识别特征的荧光发射光谱的宽谱性质。这限制了在混合 物中可以同时检测的分析物的数量，因为在荧光团之间存在大的光谱发射重叠。 提供分子特征性光谱的另一种分子技术是拉曼光谱法。不像使用荧光法所观测到 的宽峰，拉曼法产生具有分子特异性的窄的轮廓分明的峰，并且能够用来在混合物中原位 识别分子。这些光谱的信息丰富，并且这种特异性能够有机会实现高阶多通道技术，然而， 拉曼散射以其基本形式使用时缺少很多真实世界多通道技术应用所需要的灵敏度。 有多种方法能够用来增强信号。表面增强拉曼散射法（SERS)利用金属的等离子 体性能来实现拉曼信号高达1〇 5至1〇6的增强。这允许多通道技术以检测水平进行，这可以 在需要直接识别分析物的某些领域中使用。 表面增强共振拉曼散射法（SERRS)是增强拉曼信号的另一种方法，并且使 用SERS的原理以及含有发色团的分析物，其中所述发色团在激光波长被用来激发样品 的区域中具有电子跃迁。SERRS检测水平可以超过荧光法所见到的水平（Faulds等， Analyst，129, 567-568(2004))高达3个数量级，并且还兼具该技术的灵敏度使其成为用于 高阶多通道技术的优异技术。每个发色团都具有独特的SERRS光谱，这允许对其进行原位 识别。 Faulds 等（Angew. Chem. Int. Ed.，46 (11)，1829-1831 (2007))已经实施了 5 通道 (plex)标记寡聚核苷酸序列，其中他们通过仔细选择染料并且通过使用两种激发波长来识 别混合物中的5种不同染料标记的寡聚核苷酸。所使用的序列对应于一范围的不同标靶。 FAM、Cy 5. 5和B0DIPY TR-X被用来标记通用反向引物，若丹明6G (R6G)被用来标记用于HPV 的探针，并且ROX被用来标记针对大肠杆菌（E.coli)157的VT2基因的探针。选择所述染 料是因为它们生成与众不同的特异性SERRS光谱。然而，由于所述染料标记具有不同的吸 光度最大值，因此它们不会以相同的激光激发频率发生共振，并且这种性能可以被用来形 成使用两种不同激光激发频率检测具有其他染料的混合物中的这些染料中的每一种染料。 使用单激发源的6种染料标记的寡聚核苷酸的多通道分析也已经被实施过并且 显示出难以通过肉眼分开光谱。Faulds等（Analyst, 2008, 133, 1505-1512 (2008))采用 了多变量分析方法，其中考虑了整个SERRS光谱而不是寻找特异性的具有判别力的拉曼波 段。使用这种方法，报告了与大肠杆菌的不同菌株相对应的6种不同DNA序列（每一种都 使用不同的可商购获得的染料标记0^、1^、？411、1￡1\0 73或141^)的第一多通道同时 检测。在这项研究中，同时采用了利用偏最小二乘回归法的探索性判别分析和监督式学 习并且使用偏最小二乘回归法实现了判别混合物中存在还是不存在特定标记的寡聚核苷 酸的能力，具有非常高的灵敏度（0.98-1)、特异性（0.98-1)、准确度（0.99-1)和精确度 (0? 98-1)。 在以上两种多通道技术实施例中，使用不同类型的标记寡聚核苷酸制备样品混合 物，所有染料都具有相同浓度。然而，对于其中一些分析物可能以相对较高的浓度存在而其 他一些分析物可能以相对较低的浓度存在的很多工业和诊断应用而言，并不是这种情况。 另外，很多有效的SERRS染料具有显著的化学相似性，导致很多染料在它们的SERRS光谱中 具有相同的特征，使得它们更加难以在混合物中进行辨析。染料吸光截面的差异还可能导 致弱散射性染料被强散射性染料所掩蔽。因此，对于很多实际应用而言，需要提供具有高程 度的多通道技术并且在一定浓度范围内每一种组分是可识别的并且能够有效地构建很多 不同多通道组合的方法。
技术实现思路
本专利技术部分地基于用于构建染料的有效组合的方法，所述染料的有效组合能够被 用来检测可以以一浓度范围存在于样品中并且可以在单波长多通道分析中进行辨别的不 同分析物。 根据本专利技术的第一方面，提供了一种用于在多通道分析中使用的试剂盒，所 述试剂盒包括主要由多种染料组成的一组染料和每一种染料与标准浓度的相关性 (association)，其中，使用表面增强拉曼光谱法（SERRS)，所述一组染料中的每一种染料在 所述一组染料中的任意另一种染料存在的情况下在这两种染料中的每一种染料的〇. 6至 1. 5的对应染料标准浓度的整个浓度范围内能够以优于90 %的灵敏度和90 %的特异性进 行识别。 根据本专利技术的试剂盒可以被用来检测样品中的不同分析物，例如通过将每一种染 料连接至配体以形成染料-配体偶联物来检测样品中的不同分析物，每一种配体能够结合 特异性分析物。所述染料即使在存在其他染料的情况下也可以被用来检测分析物。当检测 来自患者的样品中的多于一种疾病的时候，这可能使有用的。而且，根据本专利技术的试剂盒可 以为使用者提供关于分析物将被检测到的更高水平的置信度（confidence)，这是因为所述 染料在所述一组染料中的任意其他染料存在的情况下在整个浓度范围内是可以进行识别 的。这可能是重要的，因为使用者可能要确信即使在染料的浓度不是精确地为标准浓度时 分析物也被检测到。 优选的是，每一种染料在所述一组染料中的任意另一种染料存在的情况下在这两 种染料中的每一种染料的0. 6至1. 5优选为0. 45至1. 5的对应染料标准浓度的整个浓度 范围内能够以优于95%的灵敏度和/或95%的特异性，更优选地为优于98%的灵敏度和/ 或97%的特异性进行识别。在其中识别分析物失败或者分析物的不正确识别可能具有严重 影响的医学诊断中，这种高水平的灵敏度和特异性是希望的。 对于所述一组染料中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评价单元，所述评价单元包括：存储器，在所述存储器上已经存储有用于多通道分析的一组染料中的每一种染料的标准光谱，所述标准光谱采用以标准浓度存在于样品中的所述染料获得；和处理器，所述处理器被布置成实施如下步骤：a)接收样品的使用表面增强拉曼光谱法生成的拉曼光谱；b)使用所述标准光谱对所述拉曼光谱进行建模，以识别存在于所述样品中的所述一组染料中的一种或者多种所述染料；c)基于被识别为存在于所述样品中的所述染料生成输出；其中，所述一组染料使得每一种染料在所述一组染料中的任意另一种染料存在的情况下在这两种染料中的每一种染料的0.6至1.5的对应染料标准浓度的整个浓度范围内能够以优于90％的灵敏度和90％的特异性通过步骤(b)的所述建模进行识别。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.05 EP 12163369.7;2012.05.04 GB 1207821.81. 一种评价单元，所述评价单元包括：存储器，在所述存储器上已经存储有用于多通 道分析的一组染料中的每一种染料的标准光谱，所述标准光谱采用以标准浓度存在于样品 中的所述染料获得；和处理器，所述处理器被布置成实施如下步骤： a) 接收样品的使用表面增强拉曼光谱法生成的拉曼光谱； b) 使用所述标准光谱对所述拉曼光谱进行建模，以识别存在于所述样品中的所述一组 染料中的一种或者多种所述染料； c) 基于被识别为存在于所述样品中的所述染料生成输出； 其中，所述一组染料使得每一种染料在所述一组染料中的任意另一种染料存在的情况 下在这两种染料中的每一种染料的〇. 6至1. 5的对应染料标准浓度的整个浓度范围内能够 以优于90 %的灵敏度和90 %的特异性通过步骤（b)的所述建模进行识别。2. 根据权利要求1所述的评价单元，其中，所述储存器在其上面已经存储有用于多种 多通道分析中的每一种多通道分析的在该多通道分析中使用的染料列表和用于所述染料 的标准光谱，所述处理器被布置成接收识别在产生所述拉曼光谱中使用的所述多个多通道 分析中的一个多通道分析的识别符并且使用在储存器中被识别为在所识别的多通道分析 中使用的染料的标准光谱对所述拉曼光谱进行建模。3. 根据权利要求1或2所述的评价系统，其中，所述储存器在其中已经存储有与所述染 料相关联的标靶，所述输出包括关于根据与这些标靶相关联的所述染料是否被识别为存在 于所述样品中而被检测为存在的标靶的报告。4. 一种包括根据前述权利要求中任一项所述的评价单元和光谱设备的系统，其中，所 述光谱设备被布置成将拉曼光谱发送至所述评价单元以进行分析。5. -种在多通道分析中使用的试剂盒，所述试剂盒包括主要由多种染料组成的一组染 料和每一种染料与标准浓度的相关性，其中，使用表面增强共振拉曼光谱法，所述一组染料 中的每一种染料在所述一组染料中的任意另一种染料存在的情况下在这两种染料中的每 一种染料的〇. 6至1. 5的对应染料标准浓度的整个浓度范围内能够以优于90 %的灵敏度和 90 %的特异性进行识别。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述一组染料中的任意一对染料的标准浓度 差小于2个数量级。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述一组染料中的任意一对染料的标准浓度 差为1 X l(Tn摩尔至1 X 1(T9摩尔。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述一组染料中的任意一对染料的标准浓度 差为4X l(Tn摩尔至3X KT1CI摩尔。9. 根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中，每一种染料与所述标准浓度的所 述相关性是每一种染料与在所述多通道分析中使用的用于识别该染料的标准SERRS光谱 的相关性，所述标准SERRS光谱使用以所述标准浓度存在于样品中的所述染料来获得。10. 根据权利要求5至9中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括用于每一种染 料的标准样品，每一种标准样品包含包括所述染料的混合物，所述染料的浓度为所述标准 浓度。11. 根据权利要求5至10中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括来自于如下列 表中的任意一个列表的至少六种染料： I) 了0￡、若丹明绿、六170520、8001?￥卩1、8001?￥丁]\?-父、卩六1、冊父、〇73、〇73.5、丁六1狀和 TYE563 ； II) 了0￡、若丹明绿、卩六1、冊父、0￥549、〇73、〇73.5、六170488、麻父和丁￥￡563; iii)B0DIPY530/550、B0DIPY FL、BODIPY TMR-X、CY3. 5、〇丫3、卩八1、冊父、若丹明绿、丁八1狀 和 TYE563。12. 根据权利要求5至11中任一项所述的试剂盒，其中，所述一组染料包括CY3. 5、 CY3、FAM、HEX、若丹明绿和 TYE563。13. 根据权利要求5至12中任一项所述的试剂盒，其中，所述一组染料包括CY3、 TAMRA、HEX、若丹明绿、JOE 和 ATT0520。14. 根据权利要求5至13中任一项所述的试剂盒，其中，所述一组染料由如下10种染 料组成 JOE、若丹明绿、AIT0520、BODIPY FL、BODIPYTMR-X、FAM、HEX、Cy3、Cy3. 5、TAMRA 和 TYE563。15. -种在多通道分析中使用的试剂盒，所述试剂盒包括一组染料，所述一组染料主要 由多种染料组成，每一种染料在该染料的浓度小于1 X 1(T9摩尔，可选地在小于5 X 10-摩 尔，并且该染料与其他...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿拉斯泰尔·里基茨，卡伦·菲切特，朱莉·格林，格雷姆·麦克内伊，布赖恩·史密斯，托马斯·瑟斯顿，伊恩·贝尔，安德鲁·伍尔夫雷伊，
申请(专利权)人：瑞尼斯豪诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB