一种测定养血清脑有效成分的方法技术

本发明专利技术涉及一种药物检测方法，特别涉及一种测定养血清脑有效成分的方法，包括步骤如下：（1）样品处理：取血浆样品，加入酸溶液和内标溶液中，涡旋混合；之后加入有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用流动相复溶后离心，取上清液进样测定；（2）采用液质联用仪进行测定。

【技术实现步骤摘要】
一种测定养血清脑有效成分的方法
本专利技术涉及一种药物检测方法，特别涉及一种测定养血清脑有效成分的方法。
技术介绍
养血清脑颗粒是天士力集团根据中医药传统理论,采用最新的工艺独家研制生产的现代中药,1999年获国家新药专利技术专利,对慢性脑供血不足(CCCI)及其他原因引起的头晕、头痛、失眠、健忘等有显著疗效，现已成为天士力集团的重点产品。养血清脑颗粒的配方描述在"一种治疗头痛的中药"、专利号为931000505的专利技术专利中，其组成包括，当归4-9%，川穹4-9%，白芍2-8%，熟地2-8%，勾藤10一15%，鸡血藤10-15%，夏枯草10一15%，决明子10一15%，珍珠母10-15%，元胡4-9%，细辛0.5-2%。"养血清脑颗粒"已经列入国家药品标准，标准号为WS3-258(Z一036)-2001(Z)。上述配方，根据临床需要也可以制备成片剂，胶囊，口服液等剂型，疗效相同。由于中药物质基础复杂，之前并没有人进行过养血清脑中主要化学成分的药动学实验，因此需要开发一个特异性好、灵敏度高、定量准确的含量测定方法来测定血浆中有效物质的含量。本实验采用液质联用仪器，建立了一种能够同时测定养血清脑中6种有效成分原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、芍药苷的血药浓度测定方法，而且该方法专属性好、灵敏度高、精密度、准确度、提取回收率和稳定性等均达到体内药物分析的要求，之后又利用该方法对6种有效成分在大鼠体内的药动学特征进行了考察。
技术实现思路
本专利技术提供一种测定养血清脑有效成分的方法，该方法可用于服药后有效成分的血药浓度的测定，有利于对服用该药物后进行有效成分的吸收利用相关的药物测定。本专利技术所述方法是针对养血清脑制剂的，所述制剂包括养血清脑颗粒，也包括用上述配方制备的养血清脑片剂，胶囊，口服液等剂型。养血清脑制剂中包括多种有效成分，目前已知的有效成分包括原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、芍药苷等，本专利技术根据临床需要，研究出一种同时测定血浆中上述6种有效成分的方法，本专利技术所述方法，采用液质联用法，所述方法的详细描述如下：（1）样品处理：取血浆样品（给包括人在内的动物服用养血清脑制剂，一定时间后，取血，分离得到血浆）1-3体积，加入0.2-2体积酸溶液和0.2-1体积内标溶液（配制方法如下：精密称定氯霉素1.0mg置于10Ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得储备液，取储备液适量并用甲醇稀释至所需浓度），涡旋混合；之后加入10-50体积有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用1-2体积液相流动相复溶后离心，取上清液进样测定，其中流动相含50%-90%A相，其余为B相；（2）采用液质联用仪进行测定：其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A0.02-5%(甲酸或乙酸)水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B、90%A)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B、90%A)；流速；0.1-0.4ml/min；柱温15-40℃；质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：-2500—-3500v；毛细管温度：250-400℃；鞘气：N2（5-25psi）；辅助气：N2（1-15arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.1-1s；采用选择反应监测模式（SRM）：原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；氯霉素m/z321→152CE=10-40V。以上检测方法，其中，步骤1中所述的酸溶液选自，盐酸，0.1-10%的甲酸或0.01-0.2%的磷酸。优选1%的甲酸或0.05%的磷酸。步骤1中所述的内标溶液是：丹参素、酮洛芬、氯霉素、弗比洛芬中的一种。步骤2中所述的有机溶剂为：乙酸乙酯，二氯甲烷或3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂。根据以上检测方法，得到相应的色谱图，根据标准曲线和相关色谱峰的面积，即可计算出各有效成分的含量。其中所述的标准曲线是将标准品原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、芍药苷作为样品，配制成不同浓度，用同样的色谱条件进行检测得到的不同浓度标准品的色谱图，得到这些成分的标准曲线。优选的，本专利技术的测定方法，步骤如下：（1）样品处理：取血浆样品1-3体积，加入0.2-2体积0.05-5mol/L的盐酸溶液和0.2-1体积100-300ng/ml浓度的丹参素、酮洛芬、氯霉素或弗比洛芬溶液适量，涡旋混合；之后加入10-50体积乙酸乙酯，二氯甲烷或3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液在3000-7000r/min下离心后取有机层，在30-55℃水浴下氮气吹干，然后用1-2体积液相复溶后离心，取上清液进样测定，其中流动相包含60%-80%A，其余为B；（2）采用液质联用仪进行测定：液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱为作为分离介质，进样后梯度洗脱；流动相A0.02-5%甲酸水，B乙腈或甲醇，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B、90%A)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B、90%A)；流速：0.1-0.4ml/min；柱温15-40℃。质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：-2500—-3500v；毛细管温度：250-400℃；鞘气：N2（5-25psi）；辅助气：N2（1-15arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.1-1s；采用选择反应监测模式（SRM）：原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；氯霉素m/z321→152CE=10-40V。更优选的，本专利技术的测定方法，步骤如下：（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入1体积0.05-5mol/L盐酸溶液和0.2-1体积内标100-300ng/L浓度的氯霉素溶液，涡旋混合10s-2min；之后加入10-50体积乙酸乙酯涡旋混合1-8min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取乙酸乙酯层，在，35℃水浴下氮气吹干，然后用，然后用1倍体积的流动相（80%A:20%B）复溶，10000-15000r/min离心1-6min后取上清液进样测定；（2）采用液质联用仪进行测定：液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱；流动相A0.1%甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定养血清脑有效成分的方法，其特征在于步骤如下：（1）样品处理：取血浆样品1‑3体积，加入0.2‑2体积酸溶液和0.2‑1体积内标溶液，涡旋混合；之后加入10‑50体积有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用1‑2体积液相流动相复溶后离心，取上清液进样测定，其中流动相含50%‑90%A相；（2）采用液质联用仪进行测定：其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A0.02‑5%甲酸、乙酸或水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：0‑2.5min10%B、90%A；2.51‑5min100%B；5.1‑20min10%B、90%A；流速；0.1‑0.4ml/min；柱温15‑40℃；质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：‑2500—‑3500v；毛细管温度：250‑400℃；鞘气：N25‑25psi；辅助气：N21‑15arb；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.1‑1s；采用选择反应监测模式：原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10‑30v;绿原酸m/z353→191或353→85CE=10‑40v;咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10‑45v；阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5‑30v；迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10‑50V；芍药苷m/z525→449或525→121CE=10‑30V；氯霉素m/z321→152CE=10‑40V。...

【技术特征摘要】
1.一种测定血浆中养血清脑有效成分的方法，其中有效成分为原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、芍药苷6种，其特征在于，步骤如下：(1)样品处理：取血浆样品1-3体积，加入0.2-2体积酸溶液和0.2-1体积内标溶液，涡旋混合；之后加入10-50体积有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用1-2体积液相流动相复溶后离心，取上清液进样测定，其中流动相含50％-90％A相；其中，所述的酸溶液选自，盐酸，0.1-10％的甲酸或0.01-0.2％的磷酸；所述的内标溶液是：丹参素、酮洛芬、氯霉素、弗比洛芬中的一种；所述的有机溶剂为：乙酸乙酯，二氯甲烷或3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂；(2)采用液质联用仪进行测定：其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A0.02-5％甲酸水、0.02-5％乙酸水或水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：0-2.5min10％B、90％A；2.51-5min100％B；5.1-20min10％B、90％A；流速；0.1-0.4ml/min；柱温15-40℃；质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：-2500—-3500v；毛细管温度：250-400℃；鞘气：N25-25psi；辅助气：N21-15arb；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.1-1s；采用选择反应监测模式：原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE＝10-30v；绿原酸m/z353→191或353→85CE＝10-40v；咖啡酸m/z179→135或179→108CE＝10-45v；阿魏酸m/z193→134或193→178CE＝5-30v；迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE＝10-50V；芍药苷m/z525→449或525→121CE＝10-30V；氯霉素m/z321→152CE＝10-40V。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤如下：(1)样品处理：取血浆样品1-3体积，加入0.2-2体积0.05-5mol/L浓度的盐酸溶液和0.2-1体积100-300ng/ml浓度的丹参素、酮洛芬、氯霉素或弗比洛芬溶液适量，涡旋混合；之后加入10-50体积乙酸乙酯，二氯甲烷或3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液在3000-7000r/min下离心后取有机层，在30-55℃水浴下氮气吹干，然后用1-2体积液相流动相复溶后离心，取上清液进样测定，其中流动相含60％-80％A相；(2)采用液质联用仪进行测定：液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱为作为分离介质，进样后梯度洗脱；流动相A0.02-5％甲酸水，B乙腈或甲醇，梯度洗脱条件：0-2.5min10％B、90％A；2.51-5min100％B；5.1-20min10％B、90％A；流速：0.1-0.4ml/min；柱温15-40℃；质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：-2500—-3500v；毛细管温度：250-400℃；鞘气：N25-25psi；辅助气：N21-15arb；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.1-1s；采用选择反应监测模式：原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE＝10-30v；绿原酸m/z353→191或353→85CE＝1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王相阳，马晓慧，李伟，褚扬，郭嘉华，李淑明，周水平，朱永宏，
申请(专利权)人：天士力制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12