养血清脑颗粒对脑神经元损伤的预防作用制造技术

本发明专利技术涉及一种中药制剂的新用途，特别涉及中药养血清脑颗粒对脑神经元损伤的预防作用，本发明专利技术实验数据表明，养血清脑颗粒对大脑中动脉缺血再灌注后脑皮层神经细胞损伤的预防作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种中药制剂的新用途，特别涉及中药养血清脑颗粒对脑神经元 损伤的预防作用。
技术介绍
脑损伤是多种损伤机制造成的共同结果，其中脑缺血最常引起神经细胞损 伤。溶栓治疗和神经保护是治疗缺血性脑卒中的两大干预策略。溶栓治疗往往有 治疗时间窗,且副作用较多。因此,神经元保护并与其他治疗方法联合应用表现出 更明显的优越性。养血清脑颗粒是由当归、川穹、鸡血藤、白芍、细辛等为主要成分组成的中 药复方制剂，临床应用于与脑微循环障碍相关的头痛、眩晕治疗。但是，对大脑 中动脉阻塞再灌注引起的大脑局部脑神经细胞的损伤是否具有保护作用等尚不 清楚，为此，本研究用大脑中动脉阻塞再灌注建立的大鼠局部脑神经细胞模型，观察养血清脑颗粒对局部缺血再灌注后，大鼠脑神经元损伤的预防作用，并通过免疫组织化学方法研究养血清脑颗粒对调亡相关的脑神经元P53、 PUMA、 Bcl-2、Caspase-3表达的影响，探讨起作用机制。
技术实现思路
本专利技术提供一种养血清脑颗粒的新的治疗用途，特别是用养血清脑颗粒预防 脑神经元损伤。养血清脑颗粒是一种已经上市的中成药物，其配方组成为当归、赤芍、川 芎、鸡血藤、勾藤、夏枯草等临床上用于治疗头痛、眩晕等症。本专利技术经过研究发现，养血清脑颗粒可以预防脑神经元损伤因而扩大了其应 用范围，为此，本专利技术的内容主要包括，用养血清脑颗粒制备一种预防脑神经元 损伤的药物。为证明本专利技术的实验效果，现将有关实验数据整列如下实验一、目的探讨养血清脑颗粒预防给药对大脑中动脉缺血再灌注后大鼠脑神经元损伤的预防作用。材料和方法1. 实验动物及分组雄性SD大鼠，体重300 350g，由北大医学部实验动物中心提供。随机分为假 手术组(Sham组，n=15)、大脑中动脉阻塞再灌注组(MCAO/R组，n=15)、养血清脑颗粒0. 4g/kg预防给药组(YXQO. 4组，ri=15)、养血清脑颗粒0. 8g/kg预防给 药组(YXQ0.8组，n=15)。预防给药组于术前90 min灌胃给予相应剂量药物。2. 药品、试剂及仪器养血清脑颗粒(天士力集团公司)，规格4gX10袋装。SP-9000免疫组织化学试 剂盒(北京中衫金桥生物技术有限公司)。羊抗P53多克隆抗体(Santa Cruz)。 兔抗PUMA多克隆抗体(Cell signaling)。小鼠抗Caspase-3单克隆抗体(Santa Cruz)。兔抗Bel-2多克隆抗体(Santa Cruz)。仪器石蜡切片机(American Opitcal，美国)。显微摄像系统(Oly即us BX51-DP70，日本)3. 大鼠线栓法缺血再灌注模型(MCAO/R)的制作复合麻醉剂(3ml/kg)腹腔麻醉大鼠后取仰卧位，做颈部前正中切口，分离暴露右 侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉及翼腭动脉，用微动脉夹暂时夹闭颈总动脉、 结扎翼腭动脉，并在颈外动脉近心端、远心端分别穿线,远心端系紧，近心端系一 个松结(备用)，在颈外动脉的两线间剪一个小口，将一预先制备好的栓线,经小口 插入颈外动脉并送入颈内动脉,插入深度(距颈总动脉分叉处)为18.5隱±0. 15 mm。外留lcm长尼龙线,缝合皮肤。栓塞lh后拔除尼龙线,此时血流再通制成再 灌注模型。术中用电热毯使大鼠保持恒定体温。术后出现左前肢偏瘫的大鼠进入 下一步实验。4. 氯化三苯四氮唑(TTC)染色各组大鼠5只,麻醉后剪下头部置于脑定位仪沿视交叉往后平均切成5片,用含 2%TTC的磷酸盐缓冲液在37'C染色30min,然后再用4%多聚甲醛固定并拍照。用 Image-Pro-Plus软件测量梗死比率(即梗死区体积占同侧大脑半球体积的百分比)。5. 光镜脑组织切片制备及Nissl染色大鼠腹腔麻醉后，经左心室插管灌注。在相应的时间点将每组大鼠快速用生理盐 水250ml (室温)灌注，再用4%多聚甲醛150ml (4°C)缓慢灌注，持续60min 左右，迅速取脑，在脑定位模具中沿视交叉冠状位切取脑组织，将其置于4%多聚甲醛溶液中后固定6 811后入30%的蔗糖中，待脑组织沉底后冰冻切片，制成 20Mm厚的切片，每隔5张切片取5张分别行常规Nissl染色，脱水封片后于光 镜下观察。6. 免疫组织化学染色切片入O. Olmol/L PBS摇洗3次后，入Triton X-100液30min (37°C)，入3% 过氧化氢20min(避光)，血清封闭lh(室温)，分别滴加1: 100抗P53、抗PUMA、 抗Bel-2、抗Caspase-3抗体50W于各组不同的切片上，置于室温下lh，入4 'C冰箱过夜。第二天复温lh后入滴加ABC试剂盒中B、 C液50ul于对应的切片 上，室温下各孵育lh，各步骤之间均入O. 01mol/L PBS摇洗3次，DAB显色，常 规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。每组各5张切片， 每张切片随机取5个视野计数阳性细胞数，并作统计分析。7. 统计学处理采用SAS8.0软件进行数据处理。检验方法为单因素方差分析，P〈0.05为有显著性意义。结果图1是TTC染色结果，白色区域代表缺血梗死区。假手术组未见梗死苍白区，I/R 组脑切片中缺血侧脑皮质及皮质下基底核都有明显的白色梗死灶。养血清脑颗粒 预防给药后梗死区域均有所减小。图2是梗死体积统计学分析的结果，与假手术组相比，1/R组梗死率明显升高， 养血清脑颗粒预给药浓度依存性降低了大鼠缺血再灌注后的梗死率。 养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑Nissl染色的影响 图3是Sham组(A1-A3)， I/R组(B1-B3)， CGO. 4+I/R组(C1-C3)和CGO. 8+I/R 组(Dl-D3)大鼠脑组织Nissl染色的结果。Sham组镜下可见正常大脑皮质各层细 胞排列整齐、规则，神经元结构完整，神经基质无水肿。基底神经节区神经元结 构也正常，神经纤维无损坏；皮质神经元胞体体积较大，胞浆淡染，内含大而圆 的泡状核，胞核规整，核仁明显，染色质分布均匀，细胞质内可见尼氏体(A1-A3)。 1/R组神经细胞排列紊乱，胞体肿胀，结构模糊。可见核固縮、核溶解。部分神 经细胞皱縮，变形呈三角形，尼氏小体减少或消失，呈现光镜下的淡染区(Bl-B3)。 CGO. 4+I/R组仍然存在部分细胞排列紊乱的情况。但是皮质神经细胞结构较清晰,胞体肿胀、核固縮、核溶解程度较1/R组明显减轻，淡染区面积减小，病变范围 明显缩小(C1-C3) 。 CGO. 8+I/R组神经元数量较多，但层次紊乱，细胞大而圆,尼氏 体深染(D1-D3)。养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑免疫组织化学染色的影响图4是Sham组(Al ， Bl， Cl, Dl )， I/R组(A2， B2, C2， D2) ， CGO. 4+I/R组(A3， B3， C3， D3) 和CGO. 8+I/R组(A4， B4,C4，D4)大鼠脑Caspase-3、 P53、 P飄、Bel-2免疫组织 化学染色的图像。Sham组Caspase-3、 P53、 PUMA、 Bcl-2均未见明显表达(Al， B1,C1,D1)。 1/R组观察半影区皮质可见P53(B2)、 PUMA(C2)的表达增强，胞核胞 浆均有表达，部分皱縮细胞则呈现均本文档来自技高网...

【技术保护点】
养血清脑颗粒在制备一种预防脑神经元损伤的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1、养血清脑颗粒在制备一种预防脑神经元损伤的药物中的应用。2、 权利要求l的应用，其特征在于，所述养血清脑颗粒是由当归25(H 420份； 川芎280-400份；白芍200-380份；熟地黄200-400份；钩藤580-750份； 鸡血藤550-780份；夏枯草600-720份；决明子500-750份；珍珠母560-750 份；延胡索200-420份；细辛30-100份为主要成分制成的中药复方制剂。3、 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是养血清脑颗粒对大脑中动脉缺 血再灌注后脑皮层神经细胞损伤的预防作用。4、 权利要求3的应用，其特征在于，所述应用是养血清脑颗粒预给药，可以浓 度依存...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩晶岩，周长满，陈春花，胡琴，胡白和，王芳，常昕，赵新荣，安丽华，
申请(专利权)人：天津天士力制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]