重组人干扰素β-1b的高压复性和组合层析制备方法技术

本发明专利技术涉及重组人干扰素β-1b(IFNβ-1b)的高压复性和组合层析制备方法，该方法包括破菌；包涵体的洗涤；高压复性和纯化；其中，高压复性采用将洗涤后的包涵体直接重悬到复性缓冲溶液中，在180-320MPa压力下作用10-16h完成复性；纯化采用一步SP FF阳离子交换层析和一步Butyl-S疏水层析组合的方法。本发明专利技术的制备方法无需变性过程，直接完成包涵体复性，同时全过程无需添加SDS，并可以使用层析的方法进行纯化，适用于大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
重组人干扰素β-1b的高压复性和组合层析制备方法
本专利技术涉及生物制药领域，具体涉及一种重组人干扰素β-1b的制备方法，尤其涉及一种先采用高压复性重组人干扰素β-1b包涵体然后使用SPFF阳离子交换和Butyl-S疏水层析组合的方法进行纯化的制备方法。
技术介绍
人β干扰素是由成纤维细胞和上皮细胞产生的一类具有广谱生物活性(包括抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用)的细胞因子，属于I型干扰素。目前人β干扰素有两种，分别为干扰素β-1a与干扰素β-1b，其中干扰素β-1b是将17位的Cys突变为Ser而成，含有165aa，分子量为18500Da。国外采用重组人干扰素β-1b治疗某些疾病，例如性疣、丙型肝炎及相关肝癌，美国FDA已于1993年批准重组人干扰素β-1b用于治疗多发性硬化症，目前市场上的重组人干扰素β-1b药品主要为Bayer公司的Betaferon和诺华公司的Extavia。重组人干扰素β-1b通过目前最常用的表达系统—大肠杆菌进行表达(US4,518,584A1)，并且以包涵体的形式存在。由于干扰素β-1b具有强烈的疏水性，其包涵体采用传统变复性手段不能够恢复蛋白的天然结构。LeoSLin等人(MethodsinEnzymology，986，119:183-192)通过SDS溶解包涵体并结合有机相抽提和凝胶过滤的方法进行变复性和纯化。该方法需要全过程添加SDS，致使后期层析纯化只能采用凝胶过滤的方法，操作繁琐，工作量大，在工业应用中存在困难，需要寻找一种新的变复性方法。高压复性蛋白质是一种新的包涵体复性技术。St.John等人(UniversityofColorado-Boulder.Dept.ofChemicalandBiologicalEngineeringThesis.1995:28)认为不同于传统变性剂将蛋白结构完全变性伸展开来，高压处理是一种温和的变性过程，它通过压力作用挤压水分子进入包涵体疏水界面并破坏其疏水结构从而使包涵体溶解，形成的是一种部分展开的过渡态，称之为折叠中间体结构，这种结构高度有序，非常接近蛋白天然态，然后在特定压力下作用一定时间后逐渐折叠恢复至蛋白天然状态，完成复性。高压复性相较于常规复性方法(稀释复性、透析复性、柱上复性)不仅可以用于许多特殊蛋白的复性，而且还可以在更高初始浓度条件下完成复性，可以很大程度上降低生产成本，减少工作量，易于工业放大。TheodoreW.Randolph等人(Proc.Natl.Acad.Sci，1999，96:13029-13033)通过一系列研究表明：使用一定的压力(150-350Mpa)可以复性蛋白质包涵体，获得活性蛋白。Leo.S.Lin等人(Methodsenzymology,1986.119:183-192),Rao.D.V等人(BiochemistryandBiotechnology,2009.158(1):140-154)在制备重组人干扰素β-1b的时候都使用了SDS溶解包涵体，对后期层析过程造成很大困难，只能采用凝胶过滤的方法进一步纯化。DeanRussell.Harde等人(JournalofInterferonandCytokineResearch,1995.15:31-37)虽然没有用到SDS溶解包涵体，但是使用了极端pH，这容易诱发脱酰胺反应使蛋白结构发生变化。Cleland.Jeffrery.L等人(US8,273,561B2)尝试使用了高压处理的手段，但是仍然使用了SDS溶解包涵体然后有机相抽提的方法，并且有三步组合层析纯化，步骤繁琐而且收率低。因此寻找一种无需变性，直接完成包涵体复性并全程无添加SDS的重组人干扰β-1b制备工艺是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组人干扰素β-1b的制备方法，特别是一种先采用高压复性重组人干扰素β1b包涵体然后使用SPFF阳离子交换和Butyl-S疏水层析组合的方法进行纯化的制备方法。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种重组人干扰素β-1b的高压复性和组合层析制备方法，包括破菌；包涵体的洗涤；高压复性和纯化。优选地，所述破菌采用高压匀浆的方法进行。优选地，所述包涵体的洗涤包括以下步骤：(1)将所述包涵体用缓冲液进行清洗，离心弃上清获得粗制包涵体；(2)在所述粗制包涵体中按1:10(m/v)加入8MUrea变性剂，0.5％β-巯基乙醇，洗涤过夜，离心弃上清；(3)将步骤(2)得到的沉淀用去离子水洗涤后，按1:10(m/v)加入2％十四烷基二甲基(3-磺丙基)氢氧化铵内盐(Zwittergent)溶液洗涤，离心弃上清，然后将所得沉淀用去离子水洗涤后获得精制包涵体。本专利技术在进行包涵体的洗涤时，步骤(1)所用到的缓冲液可以是现有技术中常用的缓冲液，例如可以是：20mMTris-HCl，1mMEDTA，1％Triton-100，pH8.0或20mMTris-HCl，1mMEDTA，1MNaCl，pH8.0或20mMTris-HCl，1mMEDTA，2MUrea，pH8.0，本专利技术优选采用上述3种缓冲液分别进行包涵体的洗涤，通过该步骤(1)的洗涤可以去除大部分杂蛋白，获得粗制包涵体。本专利技术在步骤(1)的基础上，通过将8MUrea变性剂，0.5％β-巯基乙醇以及2％Zwittergent溶液分别对粗制包涵体作进一步洗涤，可以显著去除特殊杂蛋白，从而获得精制包涵体。优选地，所述高压复性采用将所述包涵体超声重悬后直接进行复性。优选地，将所述包涵体的重悬液加到复性缓冲溶液中，混匀后在180-320MPa压力下作用10-16h。本专利技术中高压复性的压力还可以选自180MPa、190MPa、200MPa、210MPa、220MPa、230MPa、250MPa、280MPa、300MPa或320MPa，优选为320MPa。本专利技术中高压复性的时间还可以选自10h、11h、12h、13h、14h、15h或16h，优选为16h。优选地，所述复性缓冲溶液包括20mMTris-HCl，0.5M精氨酸，pH8.0和0.5％Zwittergent，GSH:GSSG＝1.0mM：0.2mM。本专利技术采用高压复性技术，不仅省略了有机相抽提和凝胶过滤步骤，而且全过程无需添加SDS，从而克服了现有技术中后期层析纯化只能用凝胶过滤方法的缺陷，具有操作简便、工作量小等优点。优选地，所述纯化方法包括SPFF阳离子交换和Butyl-S疏水层析。优选地，所述SPFF阳离子交换层析方法包括将高压复性获得的样品稀释10倍后上样，上样结束后先用5％洗脱缓冲液淋洗，然后用5-40％洗脱2-3柱体积。优选地，所述SPFF阳离子交换层析方法用到的平衡缓冲溶液为20mMPB，pH7.0，所述洗脱缓冲液为20mMPB，1MNaCl，pH7.0。优选地，所述Butyl-S疏水层析方法包括将SPFF阳离子交换层析获得的样品中添加AS至终浓度为0.4M，然后用Butyl-S柱进行纯化；优选地，所述Butyl-S疏水层析方法中用到的平衡缓冲液为20mMPB，0.4MAS，pH7.0，洗脱缓冲液为20mMPB，pH7.0，直接以100％洗脱缓冲溶液进行洗脱。本专利技术采用一步SPFF阳离子交换层析和Buty本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人干扰素β‑1b的高压复性和组合层析制备方法，其特征在于：所述方法包括破菌；包涵体的洗涤；高压复性和层析纯化。

【技术特征摘要】
1.一种重组人干扰素β-1b的高压复性和组合层析制备方法，其特征在于：所述方法包括破菌；包涵体的洗涤；高压复性和层析纯化；所述制备方法无需包涵体变性过程，将所述包涵体重悬后直接完成包涵体复性，省略有机相抽提和凝胶过滤步骤，同时全过程无需添加SDS；所述包涵体的洗涤包括以下步骤：(1)将所述包涵体用缓冲液进行清洗，离心弃上清后获得粗制包涵体；(2)在所述粗制包涵体中按1:10(m/v)的比例加入8MUrea变性剂，添加0.5％β-巯基乙醇，洗涤过夜，离心弃上清；(3)将步骤(2)得到的沉淀用去离子水洗涤后，按1:10(m/v)的比例加入2％Zwittergent溶液洗涤，离心弃上清，然后将所得沉淀用去离子水洗涤后获得精制包涵体；所述高压复性采用将所述包涵体的重悬液加到复性缓冲溶液中，混匀后在180-320MPa压力下作用10-16h；所述纯化方法包括SPFF阳离子交换和Butyl-S疏水层析。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述破菌采用高压匀浆的方法进行。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高压复性采用将所述包涵体的重悬液加到复性缓冲溶液中，混匀后在320MPa压力下作用16h。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复性缓冲溶液为20mMTris-HCl，0.5M精氨酸，pH8.0，0.5％Zwittergent，GSH:GSSG＝1.0mM:0.2mM。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SPFF阳离子交换层析方法包括将高压复性获得的样品稀释10倍后上样，上样结束后先用5％洗脱缓冲液淋洗，然后用5-40％洗脱2-3柱体积。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SPFF阳离子交换层析方法用到的平衡缓冲溶液为20mMPB，pH7.0，所述洗脱缓冲液为20mMPB，1MNaCl，pH7.0。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Butyl-S疏水层析方法包括将SPFF阳离子交换层析获得的样品中添加硫酸铵至终浓度为0.4M，然后用B...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永东，苏志国，王祺，张纯，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11