急性白血病病理演变前期Evi-1mRNA原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用技术

本发明专利技术公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与急性白血病早期病理演变有密切相关Evi-1的方法，包括以下步骤：(1)在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明专利技术的试剂盒和检测方法可在RNA水平上检测Evi-1表达量，比现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的白血病前期RNA水平筛查，同时，本发明专利技术的检测方法简单方便，成本低，便于县区级医院推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及急性白血病病理演变RNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。 
技术介绍
研究人员发现了导致急性白血病复发的一个基因，如果能找到抑制该基因发挥作用的方法，就有可能防止急性白血病的复发。急性白血病患者中有70％到80％的人都会复发。其原因是数量极少的白血病干细胞反复分裂，使白血病细胞大量增殖。抗癌药物虽然能够杀灭白血病细胞，但难以杀灭其中的白血病干细胞，造成急性白血病屡治屡发。研究证实急性白血病复发患者体内的基因“Evi-1”在造血干细胞中非常活跃，这一基因作用于白血病干细胞，使其不断分裂，导致白血病细胞大量增殖。研究人员从患白血病的实验鼠体内取出白血病细胞，去除了“Evi-1”基因后再移植到10只健康实验鼠体内。研究小组还给另外10只健康实验鼠完整移植了白血病细胞(含“Evi-1”)。结果发现，前一组实验鼠比后一组实验鼠平均晚发病一个月；而在杀灭两组实验鼠体内的白血病细胞后，前一组实验鼠没有复发急性白血病，后一组却再次发病。研究人员认为，对照实验已经说明，“Evi-1”对急性白血病的发作和复发有推动作用，而这与它作用于白血病干细胞有直接关系。本专利技术人在实验研究中对急性白血病患者的外周血白细胞进行检测，发现Evi-1基因过度表达，表明Evi-1基因是急性白血病干细胞的转移源头，检测Evi-1基因能预测急性白血病患者复发的可能，检测Evi-1基因就可能预测急性白血病复发几率。 随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功 能产物(mRNA水平或microRNA)上做更精确的早期筛查和诊断，在急性白血医治后的早期就可以预测复发的风险。 本专利技术采用核酸原位杂交技术和免疫组化方法对Evi-1急性白血病复发的早期预警进行检测分析。 本专利技术人在研究中发现Evi-1作为急性白血病复发的预警有非常重要的临床诊断意义。Evi-1在急性白血病复发前期有高表达。他作于急性白血病复发前期的筛查有非常重要的临床意义。 专利技术人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，专利技术人在开发和生产重大疾病的RNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创新。特别是筛选临床标本(正常人群、癌症高危人群、肿瘤患者)，突破了正常组织与肿瘤组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的RNA水平，与癌症早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的预防性诊治，其中包括急性白血病及急性白血病复发的早期预测，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防占位性癌症和急性白血病。 目前，Evi-1表达谱检测方法用Northern杂交、表达芯片、实时荧光定量PCR和Solexa测序等分析技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测RNA比基因分析更科学(DNA分析大部分在易感性的表象上，RNA是功能性体现)，比蛋白分析更可靠(RNA与蛋白转录有时候不同步)。根据现有的文献资料采用原位杂交技术和组化免疫方法检测Evi-1mRNA水平表达量的检测技术及试剂盒未见报道。 本专利技术人在针对创新性专利技术的要求，用原位杂交技术进行检测，结果表明急性白血病患者经治疗后Evi-1高表达，病患存在高度复发风险，应为患者的白血病干细胞在造血系统中大量存在，表明Evi-1可用为急性白血病复发前期筛查的重要标志物。 原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与 细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。 原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。 根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本专利技术采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针(RNA)和检测的靶RNA是采用碱基互补(杂交互补)的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没有影响。 综上所述，本专利技术的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。其次，本专利技术还要提供上述试剂盒用于急性白血病复发前期筛查。 
技术实现思路
为实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下： 本专利技术首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针分别具有序列表SEQ ID NO.1所示序列号：X54989，核苷酸序列长度是3570bp，CDS是268...3423bp，位于染色体5q32″上，本专利技术的探针是CDS中的一段序列，从901...1201bp，全长360bp。 本专利技术试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。 本专利技术试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。 本专利技术试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。 本专利技术试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。 本专利技术的癌变前期Evi-1筛查试剂盒应用价值在于，急性白血病前期复发的筛查。 本专利技术还提供一种Evi-1原位杂交的检测方法，包括以下步骤： (1)在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和 (2)检测所述杂交复合体。 本专利技术所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时。 本专利技术所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本。 本专利技术的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以Evi-1为检测对象，合成探针是Evi-1序列，检测的底物是人体血液标本白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针分别具有序列表SEQ ID NO：X54989所示的序列CDS中一段序列，从901...1261bp。

【技术特征摘要】
1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，
所述的杂交探针分别具有序列表SEQ ID NO：X54989所示的序列CDS
中一段序列，从901...1261bp。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射
性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米
材料。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。
6.一种Evi-1基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下
步骤：
(1)在权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云福，裘建英，裘霖，张玉丽，
申请(专利权)人：嘉兴瑞康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33