一种用于鉴别贝类两种近缘物种或鉴定其杂交后代的方法技术

本发明专利技术涉及物种鉴别及鉴定技术，具体说是用于鉴别贝类两种近缘物种或其杂交后代的鉴定方法。利用细胞核内的DNA条形码基因PCR扩增技术和高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）方法相结合鉴别近缘物种或鉴定其杂交后代。本方法从样品准备到获得结果只需要半天时间即可，且多数时候是在机器中运行，不需要繁琐的实验操作。由于采用溶解曲线的方法呈现，不同的峰形代表不同的序列特征，因此可以直观的判断结果。采用本发明专利技术所获得的结果是通过遗传物质DNA所获得的结果，无论国内国际同行或专家都是认可相关数据的。而采用普通的表型鉴定的方法来确定物种名称以及是否为杂交后代都很难让人信服。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及物种鉴别及鉴定技术，具体说是用于鉴别贝类两种近缘物种或其杂交后代的鉴定方法。利用细胞核内的DNA条形码基因PCR扩增技术和高分辨率熔解曲线（High?Resolution?Melting，HRM）方法相结合鉴别近缘物种或鉴定其杂交后代。本方法从样品准备到获得结果只需要半天时间即可，且多数时候是在机器中运行，不需要繁琐的实验操作。由于采用溶解曲线的方法呈现，不同的峰形代表不同的序列特征，因此可以直观的判断结果。采用本专利技术所获得的结果是通过遗传物质DNA所获得的结果，无论国内国际同行或专家都是认可相关数据的。而采用普通的表型鉴定的方法来确定物种名称以及是否为杂交后代都很难让人信服。【专利说明】
本专利技术涉及物种鉴别及鉴定技术，具体说是用于鉴别贝类两种近缘物种或其杂交后代的鉴定方法。 技术背景 中国沿海贝类种类繁多，分类复杂。一些经济贝类的研究已经有了一定的基础，其中一些通过外部形态难鉴定的贝类也从分子生物学的水平进行了深入研究。但是由于受到技术手段的限制，这些专业的知识很难应用到实际生产和研究等实践中。很多近缘物种共同生活在一起，仍然难以通过外形准确判断和鉴别。近年来，科学家专利技术了很多新的技术通过遗传物质对贝类进行物种鉴定。遗传物质包括COI，16S rDNA等线粒体基因，鉴定技术包括PCR，RFLP等。然而遗传物质分为线粒体和细胞核两部分，COI, 16S rDNA等线粒体基因在应用中有一定的限制性，比如无法用于准确追踪遗传物质是否来源与双亲并鉴定杂交后代等。而传统方法仅通过PCR产物和琼脂糖凝胶电泳的方法判断结果，通过这些方法获得的不同物种的结果差异太小，经常需要已知的确切物种作为对照。随着牡蛎基因组测序的完成，贝类性状的分子解析工作进展迅速，但是对于贝类物种鉴定技术仍然不能满足严谨的科学实验要求。同时，物种不明确，对于当地渔民或管理部门充分利用和保护当地生物资源造成障碍，也难以通过确切的技术手段检测外来入侵生物与本地物种是否存在杂交现象，造成物种资源的破坏。在此背景下，需要继续开发精确快捷的鉴定技术以满足现在的需求。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种准确、快速、经济、适用范围广泛的鉴别贝类两种近缘物种或鉴定其杂交后代的方法。克服现存贝类物种鉴定方法中繁琐、耗时、花费高以及准确度差的缺点。 为解决以上问题本专利技术提供以下技术方案: ，利用细胞核内的DNA条形码基因PCR扩增技术和高分辨率熔解曲线(High Resolut1n Melting，HRM)方法相结合鉴别近缘物种或鉴定其杂交后代。 鉴别近缘物种的具体步骤为: I)根据多个目标个体的表征确定目标个体是否属于待定的两种近缘物种并确定它们所属近缘物种的种类， 若目标个体表型不同，则直接鉴别为不同物种，若表型相同或相近，则分析它们所属近缘物种的种类A或B， 2)提取每个目标个体的DNA作为模板； 3)根据核酸数据库中A和B的细胞核DNA条形码基因，进行序列比对，判断其序列差异，选择存在单核苷酸多态性SNP或插入缺失多态性InDel的区域，在该区域两侧序列保守的位置设计一对引物；同时预测引物间的PCR扩增序列信息，并对DNA模板进行PCR扩增，获得扩增产物； 4)根据预测的引物间的PCR扩增序列信息通过公式计算两种近缘物种扩增序列熔点的高与低:t=2X (A+T)+4X (G+C);计算得出A和B的t值，计为tA和tB，比较tA和tB的大小； 5)将扩增产物进行HRM检测，将得到的荧光信号转化成熔解曲线，以温度作为横坐标，荧光强度的变化率为纵坐标得到熔解曲线； 6)根据得到的曲线表型将多个目标个体分为两类，其熔解曲线最高点所对应的横坐标即为Tm值，计为T1和T2 ； 7)将Tm值的比较结果同扒和tB的比较结果进行对比，若tA>tB，则Tm值较大的样品属于A物种；若tA〈tB，则Tm值较大的样品属于B物种。 所述序列比对是利用NCBI的在线序列比对服务或者ClustalX软件查找两物种序列的差异。 所述细胞核内的DNA条形码基因为核糖体基因内转录间隔区ITS基因序列。 所述用于鉴定贝类两种近缘物种杂交后代的方法 I)将两个近缘物种杂交后所得杂交后代提取目标个体的DNA作为模板； 2)根据核酸数库中两个纯种亲代的细胞核DNA条形码基因，进行序列比对，判断其序列差异，选择存在单核苷酸多态性SNP或插入缺失多态性InDel的区域，在该区域两侧序列保守的位置设计一对引物，以亲代设计的一对引物为其后代的引物，进行PCR扩增； 3)将扩增产物进行HRM检测；将得到的荧光信号转化成熔解曲线与亲代得到的熔解曲线作对比； 4)根据检测得到曲线的Tm峰值为2个，确定其为杂交后代，所得曲线的Tm与两个亲代的Tm相对应，即确定其为两个亲代物种的杂交后代。 所述目标个体的DNA模板采用水煮法获得后即可使用。 所述水煮法是将目标个体的单个幼虫或小于0.2mm直径的组织样品放入含有10-20 μ I灭菌超纯水的PCR管中，在PCR仪(B1er，日本)上95°C加热30min，冷却至室温后即可置于_20°C冰箱中保存待用。 所述近缘物种是指隶属于同一个属，亲缘关系接近，表型相同或相近，从表型上看容易混淆不易分清，难以通过表型明确鉴别的不同物种。 本专利技术依靠来源于细胞核的核酸序列在物种间存在稳定的SNP或InDel差别而进行物种鉴定，并引入高分辨率熔解曲线方法直观的表现出这一差异，使得检测结果更加准确、易读，并基于父母本双方的核基因可以同时遗传给杂交后代的原理而建立一套用于鉴定不同物种间杂交后代的技术平台。 本专利技术所具有的优点: 1.方法简便:本方法从样品准备到获得结果只需要半天时间即可，且多数时候是在机器中运行，不需要繁琐的实验操作。 2.结果直观:由于采用溶解曲线的方法呈现，不同的峰形代表不同的序列特征，因此可以直观的判断结果。 3.灵敏准确:所使用的模板DNA可以不经过氯仿法等传统耗时的方法，而是采用直接用水煮沸的方法获得微量DNA即可。由于PCR引物之间的序列存在明显的种间差异，可以准确的获得不同物种的特征信息。 4.应用广泛:本专利技术所涉及的近缘物种鉴别的方案适用于所有物种间具有稳定的DNA序列差异的生物，杂交后代鉴定的方法适用于所有生殖方式为父母本细胞核融合形式的生物。 5.标准通用:采用本专利技术所获得的结果是通过遗传物质DNA所获得的结果，无论国内国际同行或专家都是认可相关数据的。而采用普通的表型鉴定的方法来确定物种名称以及是否为杂交后代都很难让人信服。 【专利附图】【附图说明】 图1采用CO1-HRM方法获得的熊本牡蛎C.sikamea (曲线a)和葡萄牙牡蛎C.angulata (曲线b)特征峰形。 图2采用本案所述的ITS-HRM方法获得的熊本牡蛎C.sikamea (曲线b)和葡萄牙牡贩C.angulata (曲线a)特征峰形。 图3熊本牡贩C.sikamea和葡萄牙牡贩C.angulata的HRM特征曲线，以及正向杂交后代(熊本牡蛎的卵子和葡萄牙牡蛎的精子受精)和反向杂交后代(葡萄牙牡蛎的卵子和熊本牡蛎的精子受精)的HRM曲线特征。杂交后代本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别贝类两种近缘物种或鉴定其杂交后代的方法，其特征在于：利用细胞核内的DNA条形码基因PCR扩增技术和高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）方法相结合鉴别近缘物种或鉴定其杂交后代。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许飞，李莉，张国范，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37