本发明专利技术涉及丹参酮ⅡA在制备皮肤癌治疗药物中的应用。本发明专利技术将多个剂量的丹参酮ⅡA在人角质形成细胞系接受长波紫外线的照射后加入细胞培养基中，研究不同剂量丹参酮ⅡA在长波紫外线引起的损伤细胞中诱导细胞凋亡的作用。该项发明专利技术建立在实验性细胞损伤模型的基础上，为研究皮肤癌细胞凋亡的信号通路机制及研发治疗皮肤癌的天然产物药物提供了依据。
【技术实现步骤摘要】
丹参酮II A的新用途
本专利技术涉及丹参酮II A在制备皮肤癌治疗药物中的应用。
技术介绍
皮肤癌分为皮肤黑素瘤和非黑素瘤性皮肤癌。在白色人种的发病率居各种肿瘤之首，随着臭氧层被破坏，亚洲人的发病率也在增加。紫外线是引起皮肤癌的最主要原因，促进被紫外线损伤和癌变的皮肤细胞凋亡是预防和治疗皮肤癌的有效手段之一。为了模拟因 紫外线引起的皮肤损伤或者癌变，前人建立了不同皮肤细胞在长波紫外线(UVA)或者中波紫外线(UVB)下的损伤模型。其中UVB因其能量较高，能大幅度的损伤皮肤细胞，但是因其波长短，在臭氧层中大部分被吸收，所以到达地面的UVB甚少。而UVA相对能量较低，但是因其波长较长，大部分穿透大气层到达地表，甚至在阴天和室内也有大量的UVA照射到人的皮肤上。角质形成细胞是皮肤表层最主要的细胞，其健康程度直接影响着其他皮肤细胞的功能和状态。始于1988年建立起来的人永生化角质形成细胞HaCaT经常用于皮肤类药品的药理研究，是很好的正常角质形成细胞的替代物，具有普通角质形成细胞的形态和表皮分化能力，并且在普通状态下没有肿瘤生成趋势。我们利用UVA和HaCaT细胞来建立皮肤细胞光损伤模型，可模拟皮肤癌的发病机制，为筛选新型预防治疗皮肤癌的药物提供良好的研究载体。丹参酮II A是从传统中药丹参根中提取的菲醌类衍生物，分子式为C19O3H2tl,经常用于心绞痛的治疗，改善胸闷和缺氧后引起的心肌代谢紊乱，在皮肤病方面，也只用于痤疮的治疗。丹参酮II A对多种肿瘤细胞具有杀伤、诱导分化和凋亡的作用。有关研究也表明其可以抑制肝癌细胞的增殖、诱导乳腺癌细胞的凋亡，在肺癌细胞中，丹参酮II A可以提高凋亡基因的表达水平、降低抑制凋亡基因的表达水平，从而达到治疗肺癌的目的。然而其在皮肤癌预防和治疗方面的应用却没有。因传统中药越来越被现代人所推崇，其中提取的天然产物将具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种丹参酮II A在制备治疗皮肤癌天然药物中的应用。本专利技术将丹参酮II A在UVA照射后加入HaCaT细胞的培养基中，24小时后用细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK8)检测细胞活性。结果证明，相比单独用丹参酮II A和单独用UVA照射的细胞，在UVA照射过后加入丹参酮II A的细胞其活性大大降低，并且不同浓度的丹参酮II A均可以有效的加剧UVA诱导的细胞活性下降。本专利技术将丹参酮II A加入HaCaT细胞的培养基中，24小时后用UVA照射细胞并在30分钟后提取细胞总蛋白并用Western Blotting法检测凋亡相关信号通路蛋白(p38和JNK)的磷酸化水平。结果证明，相比单独用丹参酮II A处理和单独用UVA照射的细胞，加入丹参酮II A并照射UVA的细胞其p38和JNK的磷酸化水平有较大的提高。本专利技术新颖之处和优点在于:1)UVA损伤模型建立方法简单； 2)UVA损伤模型的建立为皮肤癌的预防和治疗提供了有效的研究平台； 3)丹参酮IIA易于获取，有利于新药规模化生产； 4)丹参酮IIA被人们所熟知，易于推广； 5)丹参酮IIA经多年临床检验，毒副作用小。【附图说明】图1为不同浓度的丹参酮II A对细胞活力的影响。图2为不同浓度的丹参酮II A促进2 J/cm2的UVA诱导的细胞凋亡； 图3为不同浓度的丹参酮II A促进2 J/cm2的UVA诱导的胞内磷酸化p38和磷酸化JNK的表达； 图4为不同浓度的丹参酮II A促进20 J/cm2的UVA诱导的细胞凋亡。【具体实施方式】实施例 一:不同剂量丹参酮II A加速2 J/cm2的UVA诱导的细胞凋亡 HaCaT细胞培养在DMEM完全培养基(DMEMW 10%灭活胎牛血清，100 U/mL青霉素和100mg/mL链霉素)于37°C、5% CO2常规培养，待细胞铺满培养瓶底部时，细胞以0.25%胰酶消化并按1:3传代并接种于12孔板，待细胞完全融合时进行实验。丹参酮II A溶于二甲基亚砜，用DMEM完全培养基稀释到所需浓度。HaCaT细胞更换常规完全培养基为含有不同浓度丹参酮II A的完全培养基，继续在37°C、5% CO2的条件下培养24小时。用DPBS冲洗2次并弃去DPBS，每个孔加入0.5 mL混有CCK8的完全培养基(CCK8:DMEM =1:10)于37°C、5% CO2常规培养2小时后每个孔吸取100 μL上清至96孔板，在450 nm的波长下读取吸光值，详情见图1。选取无细胞毒性的低浓度丹参酮II A进行后续实验。融合后的细胞分为对照组、仅UVA处理组、丹参酮II A和UVA共同处理组。照射前弃去培养基，用DPBS漂洗2次；重新向所有孔中加入0.5 mL DPBS。2 J/cm2的UVA照射时，细胞培养板距紫外灯管15 cm并置于紫外辐照仪内部中央。对照组和仅丹参酮II A处理组用锡箔纸盖住，照射后DPBS由加有不同浓度丹参酮II A (8.5、17、34μΜ)的完全培养基替换并继续培养24小时。用DPBS冲洗细胞2次，弃去DPBS后每个孔加入0.5 mL混有CCK8的DMEM完全培养基(CCK8:DMEM =1:10)于37°C、5% CO2常规培养2小时后每个孔吸取100 μL上清至96孔板，在450 nm的波长下读取吸光值并计算其相对细胞活力。详情见图2。结果发现，丹参酮II A可以加剧UVA照射后细胞活力的下降，并且随着浓度的升高细胞活力随之降低。经8.5 μΜ的丹参酮II A处理过的细胞对比仅UVA照射组,细胞活力没有显著差异；经17 μΜ的丹参酮II A处理过的细胞对比仅UVA照射组，细胞活力下降了 20% ；经34 μΜ的丹参酮II A处理过的细胞对比仅UVA照射组，细胞活力更是下降了 33%。丹参酮II A可以有效的促进被UVA损伤的细胞凋亡。实施例二:不同剂量丹参酮II A促进2 J/cm2的UVA诱导的胞内磷酸化p38和磷酸化JNK的表达 HaCaT细胞培养在DMEM完全培养基(DMEM加10%灭活胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素)于37°C、5% CO2常规培养，待细胞铺满培养瓶底部时，细胞以0.25%胰酶消化并按1:3传代并接种于12孔板，待细胞完全融合时进行实验并分为对照组、仅丹参酮II A处理组、仅UVA处理组、丹参酮II A和UVA共同处理组。照射前24小时在对应细胞组内加入8.5、17、34μΜ丹参酮II Α，照射前弃去培养基，用DPBS漂洗2次；重新向所有孔中加入0.5 mL DPBS。2 J/cm2的UVA照射时，细胞培养板距紫外灯管15 cm并置于紫外辐照仪内部中央。对照组和仅丹参酮II A处理组用锡箔纸盖住，照射后DPBS由完全培养基代替，继续培养30分钟后提取总蛋白并用蛋白质印迹法检测磷酸化及总p38、JNK信号通路蛋白，详情见图3。印迹图像用软件Image J分析灰度值,并用Ρ_ρ38/ β -actin、P-JNK/ β -actin和P-Erk/ β -actin衡量其磷酸化水平,其中β -actin为肌动蛋白，作为内参。具体如下表:本文档来自技高网...
【技术保护点】
丹参酮ⅡA在制备皮肤癌治疗药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.丹参酮II A在制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：翁新楚，史维刚，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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