在丝状真菌宿主细胞中产生多种重组多肽的方法技术

本发明专利技术涉及构建用于产生具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株的方法。本发明专利技术还涉及在丝状真菌菌株中产生具有生物活性的多种重组多肽的方法。本发明专利技术还涉及表达具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及构建用于产生具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株的方法。本专利技术还涉及在丝状真菌菌株中产生具有生物活性的多种重组多肽的方法。本专利技术还涉及表达具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株。【专利说明】 序列表的引用 本申请含有计算机可读形式的序列表，其通过引用的方式合并入本文。专利
本专利技术涉及。
技术介绍
在丝状真菌宿主细胞中重组产生多肽可以为生产商业相关量的多肽提供更为合意的载体。多肽的重组产生通常通过构建表达盒来实现，其中在表达盒中，将编码多肽的DNA置于来自调控基因的启动子的表达控制下。通常通过质粒介导的转化将表达盒导入到宿主细胞中。然后通过在表达盒中含有的启动子适当发挥作用所必需的诱导性条件下培养所转化的宿主细胞来实现多肽的生产。 可以通过涉及原生质体形成、原生质体的转化和细胞壁的再生的方法以本身已知的方式用载体转化丝状真菌细胞。用两种或更多种载体单独或一起(共转化)转化丝状真菌宿主细胞的效率是非常低的，并受到可用的可选择性标记物的可得性的限制。 本领域需要一些方法，通过将串联表达构建体定向至一个或多个(例如几个)特定基因组基因座来构建能够表达多种重组多肽的丝状真菌菌株，从而实现所需表达量的所有目标多肽。 本专利技术提供在丝状真菌宿主细胞中产生多种重组多肽的改进方法。
技术实现思路
本专利技术涉及构建用于产生具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株的方法，包括: (a)通过向丝状真菌菌株中导入第一串联构建体，通过祀向整合(targetedintegration)来取代内源性第一基因，该第一串联构建体包含:(i)第一基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合；(ii) 一个或多个(例如，几个)第一可选择性标记物；(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸；(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸；和(V)第一基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合； (b)通过向丝状真菌菌株中导入第二串联构建体，通过靶向整合来取代内源性第二基因，该第二串联构建体包含:(i)第二 基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合；(ii) 一个或多个(例如，几个)第二可选择性标记物；(iii)与第三启动子和第三终止子可操作连接的编码具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸；(iv)与第四启动子和第四终止子可操作连接的编码具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸；和(V)第二基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；或 (c)(a)和(b)的组合。本专利技术还涉及丝状真菌菌株，其包含: (a)通过向丝状真菌菌株中导入第一串联构建体经靶向整合被取代的内源性第一基因，该第一串联构建体包含:(i)第一基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合；(ii) 一个或多个(例如，几个)第一可选择性标记物；(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸；(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸；和(V)第一基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合； (b)通过向丝状真菌菌株中导入第二串联构建体经靶向整合被取代的内源性第二基因，该第二串联构建体包含:(i)第二基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合；(ii) 一个或多个(例如，几个)第二可选择性标记物；(iii)与第三启动子和第三终止子可操作连接的编码具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸；(iv)与第四启动子和第四终止子可操作连接的编码具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸；和(V)第二基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；或 (c)(a)和(b)的组合。 本专利技术还涉及在丝状真菌菌株中产生具有生物活性的多种重组多肽的方法，其包括: (A)在有益于产生多肽的条件下培养丝状真菌宿主细胞，其中该丝状真菌宿主细胞包含:(a)通过靶向整合用第一串联构建体取代的内源性第一基因，该第一串联构建体包含(i)第一基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii)一个或多个(例如，几个)第一可选择性标记物，(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(V)第一基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；(b)通过靶向整合用第二串联构建体取代的内源性第二基因，该第二串联构建体包含(i)第二基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii) 一个或多个(例如，几个)第二可选择性标记物，(iii)与第三启动子和第三终止子`可操作连接的编码具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸，(iv)与第四启动子和第四终止子可操作连接的编码具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸，和(V)第二基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；或(c) (a)和(b)的组合；以及任选地 (B)回收多种重组多肽。 本专利技术还涉及串联构建体，其包含:(i)基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合；(ii)一个或多个(例如，几个)可选择性标记物；(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸；(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸；和(V)基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合。 本专利技术还涉及构建用于产生具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株的方法，其包括: (a)通过祀向整合向内源性第一基因座中插入第一串联构建体,该第一串联构建体包含:(i)第一基因座的同源5’区、其同源侧翼区或其组合；(ii) 一个或多个第一可选择性标记物；(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸；(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸；和(V)第一基因座的同源3’区、其同源侧翼区或其组合； (b)通过靶向整合向内源性第二基因座中插入第二串联构建体，该第二串联构建体包含:(i)第二基因座的同源5’区、其同源侧翼区或其组合；(ii) 一个或多个第二可选择性标记物；(iii)与第三启动子和第三终止子可操作连接的编码具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸；(iv)与第四启动子和第四终止子可操作连接的编码具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸；和(V)第二基因座的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；或 (c)(a)和(b)的组合。 本专利技术还涉及丝状真菌菌株，其包含:(a)通过靶向整合经插入第一串联构建体而修饰的内源性第一基因座，该第一串联构建体包含(i)第一基因座的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii) 一个或多个第一可选择性标记物，(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(V)第一基因座的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；(b)通过靶向整合经插入第二串联构建体而修饰的内源性第二基因座，该第二串联构建体包含(i)第二基因座的同源5’区、其同源侧翼区或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建用于产生具有生物活性的多种重组多肽的丝状真菌菌株的方法，其包括：(a)通过向丝状真菌菌株中导入第一串联构建体，通过靶向整合取代内源性第一基因，所述第一串联构建体包含(i)所述第一基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii)一个或多个第一可选择性标记物，(iii)与第一启动子和第一终止子可操作连接的编码具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)与第二启动子和第二终止子可操作连接的编码具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(v)所述第一基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；(b)通过向所述丝状真菌菌株中导入第二串联构建体，通过靶向整合取代内源性第二基因，所述第二串联构建体包含(i)所述第二基因的同源5’区、其同源侧翼区或其组合，(ii)一个或多个第二可选择性标记物，(iii)与第三启动子和第三终止子可操作连接的编码具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸，(iv)与第四启动子和第四终止子可操作连接的编码具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸，和(v)所述第二基因的同源3’区、其同源侧翼区或其组合；或(c)(a)和(b)的组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·亚韦，金绮明，
申请(专利权)人：诺维信股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US