一种以花梗为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法技术

本发明专利技术涉及植物快速繁殖技术领域，旨在提供一种以花梗为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法。该种方法包括步骤：材料采取、愈伤诱导培养基配置、外植体接种及愈伤组织诱导、小植株再生、小植株的继代培养、小植株的出瓶种植。本发明专利技术突出具有污染率低、愈伤诱导率高、愈伤团块大、愈伤胚性好、再生能力强、增殖率高的特点，特别对于本发明专利技术以花梗为外植体，污染率可降低为0，可获得高达100%的愈伤诱导率，愈伤团块再生率达100%，胚性高，每段1cm花梗外植体可获得60-80株小植株。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及植物快速繁殖
，旨在提供。该种方法包括步骤：材料采取、愈伤诱导培养基配置、外植体接种及愈伤组织诱导、小植株再生、小植株的继代培养、小植株的出瓶种植。本专利技术突出具有污染率低、愈伤诱导率高、愈伤团块大、愈伤胚性好、再生能力强、增殖率高的特点，特别对于本专利技术以花梗为外植体，污染率可降低为0，可获得高达100%的愈伤诱导率，愈伤团块再生率达100%，胚性高，每段1cm花梗外植体可获得60-80株小植株。【专利说明】
本专利技术是关于植物快速繁殖
，特别涉及。
技术介绍
百合胚性愈伤组织再生体系相比其他再生体系如芽再生体系，具有最高的增殖率和扩繁率，对优良种质的保存有重要意义。此外，百合胚性愈伤组织再生体系也是百合遗传转化体系的决定性基础，进而影响百合的基因工程改良。目前建立百合愈伤再生体系多以田间鳞茎的鳞片为外植体，其缺陷是鳞茎由于长期处于土壤环境中，携带病菌多，使组织培养消毒要求严格，污染率较高。此外，当需要建立野生百合种质的实验室离体体系时，以鳞茎为外植体，只能采用花期后挖取种球，其突出的不足有二:首先，野生百合位置的确定和种类的辨认很大程度是依靠醒目的花器官及其特征，花期后野生百合地上部分已全部或部分枯萎，尤其是花器官的衰败和花被片脱落使其种类难以辨认，易造成种质资源的混淆；其次，挖取种球等同于对野生资源完全的采集，对于珍稀濒危种类更是难以回复的破坏。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种污染率低、愈伤诱导率高、愈伤团块大、愈伤胚性好、再生能力强、增殖率高，且对种质资源的破坏小的建立百合胚性愈伤再生体系的方法。为解决上述技术问题，本专利技术的解决方案是:提供一种以花梗为`外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法，包括以下步骤:步骤一:材料采取:在百合花期，取百合长0.5~2.0cm的(幼嫩)花蕾，花蕾带长I~1.5cm的花梗，置于封口袋中在4摄氏度的冰箱中冷藏I周后，再进行后续操作；步骤二:愈伤诱导培养基配置:愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有 30g/L 的鹿糖、5g/L 琼脂、0.25mg/L6-节氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_ΒΑ)、0.25 ~1.5mg/L 的 2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2, 4-D),愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8 ；将配置好的愈伤诱导培养基溶液灭菌后，在超净工作台上进行分装，即将愈伤诱导培养基溶液倒入(玻璃或塑料)培养皿中，待愈伤诱导培养基溶液凝固成愈伤诱导培养基后，用保鲜膜或锡纸将至少一个盛有愈伤诱导培养基的培养皿包裹好，放在无菌洁净环境(如组培室)下存放；步骤三:外植体接种及愈伤组织诱导:将步骤一中处理后的花蕾，在添加了洗涤精的自来水中浸泡5~30min，再在流水下冲洗0.5~2h清洗干净，然后在超净工作台上进行消毒接种；消毒方法如下:用添加了 0.1%ν/ν吐温的l%w/v的次氯酸钠溶液，将清洗干净的花蕾进行表面消毒8~15min，然后用无菌水冲洗3遍；消毒后进行接种:用镊子和解剖刀将花蕾上的花梗切下，将长Icm的花梗接种于步骤二中制作的盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，花梗需先切掉其端部褐化部分产生新鲜切口，然后用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后接种，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、黑暗条件下培养8~40天，完成愈伤组织的诱导，出现愈伤组织团块；步骤四:小植株再生:外植体在愈伤诱导培养基上培养40~70天后，开始分化再生出小植株，然后将外植体转接到新鲜的愈伤诱导培养基上，在照度为18001ux、12h光照/12h黑暗的光照条件下，培养90~120天后，在超净工作台上将小植株从愈伤组织团块上分离下来，转入继代培养基培养;小植株在继代培养基上生长4周后(平均直径达到Icm以上)，可进行步骤六中的出瓶种植，或者不出瓶，进行步骤五中的继代以维持百合离体鳞茎再生体系，再进行步骤六中的出瓶种植；所述继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升继代培养基中添加有4 .43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、4~8g/L琼月旨、O ~0.2mg/L6-节氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0 ~0.2mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)，继代培养基的pH值为5.8 ; ( α-萘乙酸不是必需的，但一定浓度的萘乙酸将有利于小植株根系生长，6-苄氨基腺嘌呤不是必需的，但一定浓度的6-苄氨基腺嘌呤将有利于小植株增殖)步骤五:小植株的继代培养:步骤四中的小植株在继代培养基上生长4周后(平均直径达到Icm以上)，不出瓶，进行继代的方法是:小植株在继代培养基上生长，基生根生长健壮，根部上端转绿后，进行小植株的转接；转接方法是:在超净工作台上，将小植株取出，将其根全部切除，叶片也从基部切除，仅保留小鳞茎和少量鳞茎盘，将小鳞茎转接到新鲜的继代培养基上，继续步骤四的培养；步骤六:小植株的出瓶种植:出瓶前进行低温锻炼，将组培容器中的继代培养基上培养的小植株，在I~5摄氏度、黑暗条件下进行30~50天的低温处理；低温处理后，将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒15~30min,然后种入育苗专用介质(如Custom growing mix, Fafard)中，小植株种入育苗专用介质中的深度在I~2cm范围内，即小鳞茎顶端距土表一球高左右，进行栽培管理，即完成百合胚性愈伤再生体系的建立。本专利技术步骤三中，诱导获得的愈伤组织团块切下或用镊子夹下来，作为遗传转化体系的受体，经农杆 菌转染或基因枪介导转化，经过筛选和鉴定，并在再生培养基上分化生根、炼苗、移栽获得百合的转基因植株；再生培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升再生培养基添加4.43gMS粉，再生培养基中还含有30~60g/L的蔗糖、4~8g/L琼脂、O~2.0mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),再生培养基的 pH 值为 5.8 ~6.0。本专利技术提供的上述方法可以用于百合愈伤组织再生体系和遗传转化体系中，具体为:对上述方法获得的愈伤组织进行继代培养后分切成小块，接种到相应继代培养基上培养；用该愈伤组织在再生培养基上分化生根，炼苗、移栽即可获得百合的组织培养植株；或将该愈伤组织作为遗传转化体系的受体，在再生培养基上分化生根，炼苗、移栽即可获得百合的转基因植株。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是:本专利技术以百合花梗为外植体，具有污染率低、材料易得的特点，其突出的优势在于体系高效率、外植体幼嫩、少病毒。对于野生百合的种质资源保存来说，在百合花期取得适量花梗用于建立实验室愈伤再生体系，而不是花期后挖取种球，以花梗特点更容易确认野本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以花梗为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：材料采取：在百合花期，取百合长0.5～2.0cm的花蕾，花蕾带长1～1.5cm的花梗，置于封口袋中在4摄氏度的冰箱中冷藏1周后，再进行后续操作；步骤二：愈伤诱导培养基配置：愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige?and?Skoog,1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25mg/L6?苄氨基腺嘌呤（6?benzyladenine,6?BA）、0.25～1.5mg/L的2,4?二氯苯氧乙酸（2,4?dichlorophenoxyacetic，2,4?D)，愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8；将配置好的愈伤诱导培养基溶液灭菌后，在超净工作台上进行分装，即将愈伤诱导培养基溶液倒入培养皿中，待愈伤诱导培养基溶液凝固成愈伤诱导培养基后，用保鲜膜或锡纸将至少一个盛有愈伤诱导培养基的培养皿包裹好，放在无菌洁净环境下存放；步骤三：外植体接种及愈伤组织诱导：将步骤一中处理后的花蕾，在添加了洗涤精的自来水中浸泡5～30min，再在流水下冲洗0.5～2h清洗干净，然后在超净工作台上进行消毒接种；消毒方法如下：用添加了0.1%v/v吐温的1%w/v的次氯酸钠溶液，将清洗干净的花蕾进行表面消毒8～15min，然后用无菌水冲洗3遍；消毒后进行接种：用镊子和解剖刀将花蕾上的花梗切下，将长1cm的花梗接种于步骤二中制作的盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，花梗需先切掉其端部褐化部分产生新鲜切口，然后用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后接种，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、黑暗条件下培养8～40天，完成愈伤组织的诱导，出现愈伤组织团块；步骤四：小植株再生：外植体在愈伤诱导培养基上培养40～70天后，开始分化再生出小植株，然后将外植体转接到新鲜的愈伤诱导培养基上，在照度为1800lux、12h光照/12h黑暗的光照条件下，培养90～120天后，在超净工作台上将小植株从愈伤组织团块上分离下来，转入继代培养基培养；小植株在继代培养基上生长4周后，可进行步骤六中的出瓶种植，或者不出瓶，进行步骤五中的继代以维持百合离体鳞茎再生体系，再进行步骤六中的出瓶种植；所述继代培养基以MS培养基(Murashige?and?Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基中添加有4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、4～8g/L琼脂、0～0.2mg/L6?苄氨基腺嘌呤（6?benzyladenine,6?BA）、0～0.2mg/Lα?萘乙酸（1?Naphthaleneacetic?acid,NAA），继代培养基的pH值为5.8；步骤五：小植株的继代培养：步骤四中的小植株在继代培养基上生长4周后，不出瓶，进行继代的方法是：小植株在继代培养基上生长，基生根生长健壮，根部上端转绿后，进行小植株的转接；转接方法是：在超净工作台上，将小植株取出，将其根全部切除，叶片也从基部切除，仅保留小鳞茎和少量鳞茎盘，将小鳞茎转接到新鲜的继代培养基上，继续步骤四的培养；步骤六：小植株的出瓶种植：出瓶前进行低温锻炼，将组培容器中的继代培养基上培养的小植株，在1～5摄氏度、黑暗条件下进行30～50天的低温处理；低温处理后，将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒15～30min，然后种入育苗专用介质（如Custom?growing?mix,Fafard）中，小植株种入育苗专用介质中的深度在1～2cm范围内，即小鳞茎顶端距土表一球高左右，进行栽培管理，即完成百合胚性愈伤再生体系的建立。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张琳，夏宜平，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：