【技术实现步骤摘要】
一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法
[0001]本专利技术涉及植物单细胞提取领域,具体是指一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法
。
技术介绍
[0002]半枝莲为唇形科黄岑属多年生草本植物,可全草入药,含有苯丙氨酸
、
生物碱
、
黄酮苷
、
皂苷
、
多糖等成分
。
临床上对于半枝莲的化学成分研究较为充分,但对其抗病的分子机制研究尚属空白,建立半枝莲遗传性能稳定的单细胞群落,有助于未来研究其具体抗肿瘤作用位点和机理
。
现有单细胞提取方式只能提取到原生质体,并不包括细胞壁,无法保证植物单细胞结构的完整性;或通过亚氯酸钠处理生物质材料进行脱木素反应,植物细胞木质素及半纤维素脱除,获得完整单细胞,但只适用于木本
、
禾本植物;压电技术制备植物单细胞样本,极易导致细胞的损坏和破碎,且操作方式繁琐
。
技术实现思路
[0003]针对上述情况,为克服现有技术的缺陷,本专利技术提供了一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法,为解决现有单细胞提取方法,只能提取得到原生质体,不包括细胞壁,本专利技术提出通过选取半枝莲幼嫩叶片为实验材料,获得大量疏松的愈伤组织,便于后续完整单细胞悬浮液的制备;同时选用含有多聚半乳糖醛酸酶
、
吗啉乙磺酸
、
风车子抑素
A4
的单细胞液体培养基,可以选择性的在溶解细胞间物质的同时不破坏植物细胞壁结构,促进形成完整单细胞 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.
一种半枝莲完整单细胞提取方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)选择健壮新鲜半枝莲植株,选取上部幼嫩叶片,使用无菌去离子水冲洗,得到半枝莲原材料;(2)在超净工作台中,将半枝莲原材料使用
70%
酒精浸泡
15
‑
30 s
,再使用无菌去离子水冲洗2‑4次,使用剪刀将半枝莲原材料剪成小块,得到半枝莲叶片组织;(3)以
MS
培养基为基础培养基,其中6‑
苄氨基嘌呤的浓度为1‑
3 mg/L、
蔗糖的浓度为
20
‑
35 g/L、
琼脂粉的浓度为4‑
6 g/L
,在玻璃烧杯中混合温度为
40
‑
60℃、
混合转速为
180
‑
200 r/min、
混合时间为5‑
8 min、
调节
pH
为
5.5
‑
6.5
,充分搅拌,得到诱导愈伤组织培养基;以
1/2MS
培养基为基础培养基,其中,风车子抑素
A4
的浓度为5‑
8 mg/L、
吗啉乙磺酸的浓度为
15
‑
20 mg/L、
多聚半乳糖醛酸酶的浓度为3‑
5 mg/L、2,4
‑
二氯苯氧乙酸的浓度为1‑
2 mg/L、6
‑
糖基氨基嘌呤的浓度为
0.4
‑
0.6 mg/L
,在玻璃烧杯中混合温度为
20
‑
28℃、
混合转速为
180
‑
200 r/min、
混合时间为5‑
8 min、
调节
pH
为
5.5
‑
6.0
,充分搅拌,得到单细胞液体培养基;(4)将半枝莲叶片组织放至诱导愈伤组织培养基中恒温
27
‑
29℃
,培养时间为
12
‑
16 d
,得到大量疏松的愈伤组织;(5)使用灭菌的镊子挑取愈伤组织,将其转移至单细胞液体培养基中,在摇床温度为
20
‑
28℃、100
‑
150 r/min
振荡速度
、
培养时间为
12
‑
24 h
,振荡培养得到完整单细胞悬浮液;(6)以
100
‑
300
目细胞过滤筛,过滤除去完整单细胞悬液中的大块细胞团,得到细胞滤液;(7)将细胞滤液以
500
‑
800 r/min
的转速离心8‑
12 min
,去除上部细胞碎片,采用
40
‑
60
目细胞过滤筛过滤,得到半枝莲完整单细胞;(8)以
50%
甘油为溶剂,其中纤维素的浓度为5‑
8 g/L、
木质素的浓度为2‑
4 g/L、
葡萄糖的浓度为3‑
6 g/L
,充分混匀,得到单细胞稳定剂;(9)将回收的半枝莲完整单细胞分装于
2mL
无菌冻存管中,加入单细胞稳定剂,体积比为
1:1
,于
‑
80℃
冷冻保存
。2.
根据权利要求1所述的一种半枝莲完整单细胞提取方法,其特征在于,步骤(1)中,所述健壮新鲜半枝莲植株选用无菌半枝莲组培幼苗;步骤(2)中,所述半枝莲原材料使用
70%
酒精浸泡浸泡
25 s
,再使用去离子水冲洗3次
...
【专利技术属性】
技术研发人员:汪华,陈晓宣,
申请(专利权)人:重庆佰东生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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