RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用，本发明专利技术提供了一种RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR慢病毒表达载体的构建和使用方法，本发明专利技术提供了利用RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR慢病毒表达载体进行慢病毒包装、浓缩、滴度测定的方法，本发明专利技术提供了一种RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR‑Jurkat T细胞，证实了利用该RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR慢病毒表达载体能够生产RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR‑T细胞，PD‑1敲减效率约75％。本发明专利技术中过表达RUNX3能帮助实体瘤CAR‑T锚定在肿瘤部位。本发明专利技术将RUNX3过表达和PD‑1敲减策略一起加入CAR慢病毒表达载体，并验证了利用该慢病毒表达载体包装的慢病毒能够成功使Jurkat T细胞表达CAR的同时，过表达RUNX3和敲低PD‑1，为后续生产RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR‑T细胞提供了基础。

Construction and application of car expression vector with RUNX3 overexpression and PD-1 knockdown

【技术实现步骤摘要】
RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用
本专利技术涉及肿瘤免疫治疗
，具体涉及一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用。
技术介绍
CAR-T(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy)即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，通常指获取肿瘤患者自体T细胞进行改造，体外扩增后回输从而杀伤肿瘤的一种免疫疗法。其基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的singlechainantibodyfragment,scFv)，是整个CAR-T的核心部件，其他结构包括一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区，跨膜区起到连接细胞内外区域的作用，当scFv与肿瘤抗原结合后，信号即可通过TCRε传导至胞内，产生淋巴细胞活化的生物学效应。CAR-T赋予T细胞以非HLA依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，避免肿瘤细胞通过下调HLA分子的表达逃避免疫攻击。这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标，因而更有利于使用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞。从全球大量开展的CAR-T临床实验来看，CAR-T技术在血液肿瘤、淋巴瘤的治疗上具有令人印象深刻的卓越疗效，而在实体瘤方面，有一些令人鼓舞的突破，但还面临着诸多难点问题需要攻克。这些难点主要包括：缺乏肿瘤细胞特异性表达的抗原，屏障存在使得淋巴细胞不易到达肿瘤组织中，免疫抑制微环境常常导致癌细胞免疫逃逸。因此寻找特异表达在癌细胞表面的膜蛋白抗原，增加肿瘤微环境中效应T淋巴细胞浸润，逆转肿瘤微环境中杀伤性T细胞功能耗竭是实体瘤CAR-T免疫治疗的重点与难点，亦是临床提高肿瘤免疫治疗效果的关键。RUNX3是RUNX家族的转录因子，能与CBFB结合形成异二聚体核心结合因子(CBF)。RUNX成员通过runt结构域识别DNA结合序列5'-TGTGGT-3'或5'-TGCGGT-3'来调节其靶基因的转录，而CBFB是一个非dna结合调节亚基，它通过变构增强RUNX特异性结合DNA的能力。最近报道显示，RUNX3能够促进淋巴细胞发育成组织滞留记忆T细胞。在CAR-T细胞中过表达RUNX3，促进其发育成组织滞留记忆T细胞，从而利用淋巴细胞组织滞留特性能帮助实体瘤CAR-T锚定在肿瘤部位，这一策略可能解决肿瘤微环境中效应淋巴细胞浸润不足的困境。PD-1是一种重要的免疫抑制分子，T细胞被激活后会上调PD-1表达，PD-1被肿瘤细胞或其他免疫性(如巨噬细胞)表面的PDL1激活后，会抑制T细胞杀伤功能，诱导效应T细胞耗竭。而且研究显示，过表达RUNX3在促进淋巴细胞组织滞留的同时，也会促进PD-1的表达。在CAR-T细胞中使用敲降PD-1策略，能够抑制PD-1表达，从而延缓通过PD-1途径介导的T细胞功能耗竭，增强CAR-T细胞杀伤能力。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法。本专利技术的目的是提供一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予实现：一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒，所述载体质粒为pLVX慢病毒载体质粒，包含人Runx3、PD-1shRNA、CAR三个部分，所述载体质粒序列如SEQIDNO.16所示。所述Runx3基因为人Runt-relatedtranscriptionfactor3。本专利技术提供了一种敲减人PD-1的shRNA，所述shRNA为：模板链序列如SEQIDNO.10所述的核苷酸序列。本专利技术提供了一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体，所述载体包括上述RUNX3和PD-1shRNA。优选的，所述表达载体为pLVX慢病毒表达载体，所述CAR为人CA9CAR。本专利技术还提供一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR重组慢病毒载体质粒的构建方法，包括以下步骤：(1)利用化学合成法得到基因片段CA9CAR-P2A，并利用酶切位点EcoRI和BamHI将基因片段CA9CAR-P2A克隆至pLVX慢病毒质粒载体；(2)以pCMV3-RUNX3质粒(义翘神州)为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示正向引物和序列如SEQIDNO.5所示反向引物进行PCR，扩增序列如SEQIDNO.6所示基因片段RUNX3，并利用酶切位点BamHI和MluI克隆入(1)中所得载体P2A之后，得到序列如SEQIDNO.9所示的RUNX3过表达的CA9CAR慢病毒质粒载体，命名为pLVX-EF1a-CA9CAR-P2A-RUNX3；(3)以pLenti-CRISPR-V2(addgene)为模板，利用序列如SEQIDNO.11所示正向引物和序列如SEQIDNO.12所示反向引物进行PCR，扩增序列如SEQIDNO.13所示基因片段U6-shPD1，并利用酶切位点ClaI克隆入上述载体质粒pLVX-EF1a-CA9CAR-P2A-RUNX3，得到序列如SEQIDNO.16所示的RUNX3过表达、PD-1敲减的CA9CAR重组慢病毒载体质粒，命名为pLVX-U6-shPD1-EF1a-CA9CAR-P2A-RUNX3。优选的，所述步骤(1)中CA9CAR采用二代CAR的组成方式，所述CA9CAR由识别CA9分子的scFv片段，CD8胞外区，CD28跨膜区，4-1BB片段，CD3ζ片段组成。本专利技术还提供利用RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR重组慢病毒表达载体包装慢病毒的方法。优选的，将重组pLVX载体质粒与psPAX2包装质粒、pMD2.G包膜质粒共同转染293T细胞，在293T细胞中进行基因转录表达后，包装成功的重组pLVX慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含慢病毒的上清液。本专利技术还提供慢病毒浓缩的方法。优选的，将收集的慢病毒上清液装于无菌50mL离心管，在管底加入5mL20％surcose-PBS溶液，4℃12000g离心4h，管底可见白色病毒颗粒。用适量PBS溶解病毒，4℃复苏24h，分装-80℃保存。本专利技术还提供一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR-JurkatT细胞。优选的，所述CAR-JurkatT细胞的制备方法包括以下步骤：(1)JurkatT细胞的培养；(2)通过所述RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒转染JurkatT细胞；(3)检测JurkatT细胞CAR和RUNX3表达。本专利技术还提供一种检测PD-1敲减效率的方法。优选的，JurkatT细胞转染PD-1shRNA慢病毒或对照慢病毒，3天后用10ug/mLPHA和50ng/mLPMA诱导PD-1表达，5天后流式细胞术检测JurkatT细胞PD-1表达情况，确定PD-1敲减效率。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒，其特征在于，所述载体质粒为pLVX慢病毒载体质粒，包含人Runx3、PD-1 shRNA、CAR三个部分，所述载体质粒序列如SEQID NO.16所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒，其特征在于，所述载体质粒为pLVX慢病毒载体质粒，包含人Runx3、PD-1shRNA、CAR三个部分，所述载体质粒序列如SEQIDNO.16所示。


2.根据权利要求1所述的RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒，其特征在于，敲减人PD-1的shRNA模板链序列如SEQIDNO.10所示核苷酸序列。


3.一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)利用化学合成法得到基因片段CA9CAR-P2A，并利用酶切位点EcoRI和BamHI将基因片段CA9CAR-P2A克隆至pLVX慢病毒质粒载体；
(2)以pCMV3-RUNX3质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示正向引物和序列如SEQIDNO.5所示反向引物进行PCR，扩增序列如SEQIDNO.6所示基因片段RUNX3，并利用酶切位点BamHI和MluI克隆入(1)中所得载体P2A之后，得到质粒pLVX-EF1a-CA9CAR-P2A-RUNX3；
(3)以pLenti-CRISPR-V2为模板，利用序列如SEQIDNO.11所示正向引物和序列如SEQIDNO.12所示反向引物进行PCR，扩增序列如SEQIDNO.13所示基因片段U6-shPD1，并利用酶切位点ClaI克隆入上述载体质粒pLVX-EF1a-CA9CAR-P2A-RUNX3，得到质粒pLVX-U6-shPD1-EF1a-CA9CAR-P2A-RUNX3。


4.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁廷波，章琦，白雪莉，汤江辉，盛剑鹏，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33