CTLA-4纳米抗体、制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，特别涉及CTLA‑4纳米抗体、制备方法及其应用。使用纳米抗体可以提高或者协同增强与抗原的结合能力。纳米抗体不具备完整的抗体结构，缺少Fc端以及Y型结构，抗原与纳米抗体结合后不容易被识别，可以轻易逃避免疫系统的捕捉。技术手段主要包括：抗原与载体连接；转入感受态细胞中，提取重组质粒；然后转染至宿主菌中进行表达；利用抗原蛋白对驼类动物进行免疫；采集外周血，抽提淋巴细胞样品的总RNA，反转录为cDNA，扩增得到VHH文库片段，将VHH文库片段插入表达载体，并转化至感受态细胞中，构建抗体免疫库；筛选抗体免疫库中的纳米抗体；验证筛选的纳米抗体与CTLA‑4抗原结合。

CTLA-4 nano-antibody, preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
CTLA-4纳米抗体、制备方法及其应用
本专利技术属于生物医学
，特别涉及CTLA-4纳米抗体、制备方法及其应用。
技术介绍
细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxicTlymphocyteas-sociatedantigen-4，CTLA-4)是一种T淋巴细胞跨膜蛋白，它最早在筛选小鼠杀伤性T细胞的cDNA文库时被发现。CTLA-4具有高度的内吞性，通常存在于胞内小体中，以二聚体的形式存在，与其配体结合不会改变它的构象。CTLA-4能够与抗原提呈细胞或者活化的T细胞表面B7受体结合，通过反向传导到信号抑制细胞的功能。研究发现高迁移率族蛋白B1能够显著降低小鼠调节性T细胞表达T淋巴细胞毒性相关抗原-4的表达水平，而用封闭TLR-4预处理后，再用高迁移率族蛋白B1作用的实验组表达的T淋巴细胞毒性相关抗原-4水平显著升高，而它升高的水平随着高迁移率族蛋白B1浓度的不同而不同。CTLA-4在免疫治疗领域受到了极大的关注。有研究者在2009年成功建立了猪CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法，结果表明他们构建的重组质粒具有效果好、敏感性高等优良特性，这为检测被病毒感染后的猪的免疫细胞中CTLA-4的表达水平的变化及猪的免疫功能提供了技术上的支持。有研究称将鼠或人的CTLA-4IgV蛋白与目的抗原融合，能显著增强动物机体细胞和体液的免疫应答。有研究者为了研究猪的CTLA-4IgV作为分子佐剂的可行性，就通过猪的外周淋巴细胞得到CTLA-4IgV的编码序列来表达相应的蛋白，然后经过蛋白融合等一系列技术的应用分析得出猪的CTLA-4IgV能作为分子佐剂促进机体的免疫应答。中国医学科学院研制出一种具有定向性、选择性杀伤肿瘤细胞的“单抗-药物”联结物，即以单克隆抗体为“载体”，携带药物精确地和肿瘤细胞结合，能在原位杀死癌细胞，而对其他正常细胞无损伤。这种综合性药物好比是专攻癌症的“生物导弹”，人们把这种治疗方法形象地比喻为导弹疗法。但是，单克隆抗体的联结物具有以下缺点：(1)单克隆抗体存在异源性。如果用于小鼠单克隆抗体的单克隆抗体，对人体的应用会产生抗鼠单克隆抗体，它不可重复应用，影响其疗效。(2)单克隆抗体体积相对较大，不能较好的进入肿瘤组织。(3)单克隆抗体开发周期长，生产成本高，产量低。(4)单克隆抗体类药物价格昂贵，研发复杂，人源化复杂，成功率有限。(5)难以大规模生产，单克隆抗体药物在建厂和生产过程中消耗的资金非常巨大(6)不稳定，容易降解，保存成本高；容易污染，维护成本高昂。在高温和强酸强碱的条件下会分解，须在低温下保存，否则就会在数周内完全失去活性。抗体能被消化系统很快降解，从而阻止了其进入大脑或其他有效作用部位。生物免疫治疗相对传统化疗或靶向治疗，有一个本质逻辑区别:“免疫治疗”针对的是免疫细胞或者说是免疫系统，而不是癌症细胞。在癌症免疫治疗中，抑制免疫检查点通路被认为是最有前景的治疗方式之一，其机制是通过抑制通路中相关靶点解除T细胞活性受抑状态，活化后的T细胞能够进攻和消灭肿瘤细胞。抗体并不直接作用于肿瘤细胞，而是通过作用于T细胞类间接杀伤肿瘤细胞；另外，它们并不是针对肿瘤表面的某种特定物质，而是系统性地增强了全身的抗肿瘤免疫反应。纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KD，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。纳米抗体包含3个高变区与4个骨架区，高变区均在同一侧。与人类抗体的VH有着同样的结构，测序显示与VH3同源性极高，但是纳米抗体的CDR1(Complementarity-determiningregion-1)与CDR3(Complementarity-determiningregion-3)相对较长。因此，将相关抗原与纳米抗体结合，在肿瘤疾病的诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。
技术实现思路
基于现有技术的缺陷，本专利技术旨在将纳米抗体与相应抗原结合，得到CTLA-4纳米抗体，并提供了其制备方法，将制备的纳米抗体其应用于肿瘤的抑制。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：CTLA-4纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：S1：合成CTLA-4免疫抗原序列片段，并进行扩增；S2：将扩增后的CTLA-4产物片段与载体连接，得到连接液；S3：将连接液转入感受态细胞中，并提取重组质粒；S4：将重组质粒转染至宿主菌中，对抗原进行表达，并对表达的抗原蛋白进行纯化；S5：利用步骤S4中得到的抗原蛋白对驼类动物进行免疫；S6：采集免疫后的驼类动物外周血，分离淋巴细胞；S7：抽提淋巴细胞样品的总RNA，反转录为cDNA，使用引物CAL-leader和CAL-CH2进行扩增，得到VHH文库片段，其中引物CAL-leader和CAL-CH2的序列分别见SEQIDNO:4和SEQIDNO:5；S8：将VHH文库片段插入表达载体，并转化至感受态细胞中，构建抗体免疫库；S9：用生物素化方法筛选抗体免疫库中的纳米抗体；S10：验证筛选的纳米抗体与CTLA-4抗原结合。进一步地，步骤S1中，对合成的CTLA-4免疫抗原序列片段进行扩增时，所用引物分别为CTLA-4上游引物和CTLA-4下游引物，序列分别见SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。进一步地，步骤S2中，所用载体为PCDNA3.1+载体。进一步地，步骤S3中，所用感受态细胞为HEK293感受态细胞。进一步地，步骤S4中，所用宿主菌为HEK293细胞。进一步地，用生物素化方法筛选得到的纳米抗体的序列见SEQIDNO:9。一种利用上述制备方法制备的CTLA-4纳米抗体。上述的CTLA-4纳米抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：与使用单克隆抗体相比，纳米抗体的CDR3具有突出，使用纳米抗体可以提高或者协同增强与抗原的结合能力。纳米抗体具有稳定的结构，保证了结合的稳定性。纳米抗体与抗原的结合位点也与单克隆抗体不同，纳米抗体可以更紧密的结合到抗原上，并且可以结合到传统抗原结合不到的地方。另一方面纳米抗体并不具备完整的抗体结构，缺少Fc端以及Y型结构，抗原与纳米抗体结合后不容易被识别，可以轻易逃避免疫系统的捕捉。纳米抗体可以在严苛的环境中保持构象不变，抗热性能较好，可以在室温下存放一周以上。而超强的耐酸碱性可以使纳米抗体更好的抵抗不同的环境，也可以增加纳米抗体的作用范围。单域重链抗体微小的体积也使它获得了较低的免疫原性，使动物长期注射蛋白成为可能。本专利技术使用人HEK293细胞株对抗原进行表达，使用哺乳动物表达系统表达人的蛋白可以最大化的保证蛋白的原始结构与活性，保证了蛋白拥有翻译后修饰以及糖基化等真核蛋白特有的修饰，可以使获取的蛋白具有较高活性。本方法使用羊驼作为免疫动物可以更好的保定以及节约抗原的用量。本方法筛选得到的纳米本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CTLA‑4纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：合成CTLA‑4免疫抗原序列片段，并进行扩增；S2：将扩增后的CTLA‑4产物片段与载体连接，得到连接液；S3：将连接液转入感受态细胞中，并提取重组质粒；S4：将重组质粒转染至宿主菌中，对抗原进行表达，并对表达的抗原蛋白进行纯化；S5：利用步骤S4中得到的抗原蛋白对驼类动物进行免疫；S6：采集免疫后的驼类动物外周血，分离淋巴细胞；S7：抽提淋巴细胞样品的总RNA，反转录为cDNA，使用引物CAL‑leader和CAL‑CH2进行扩增，得到VHH文库片段，其中引物CAL‑leader和CAL‑CH2的序列分别见SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；S8：将VHH文库片段插入表达载体，并转化至感受态细胞中，构建抗体免疫库；S9：用生物素化方法筛选抗体免疫库中的纳米抗体；S10：验证筛选的纳米抗体与CTLA‑4抗原结合。

【技术特征摘要】
1.CTLA-4纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：合成CTLA-4免疫抗原序列片段，并进行扩增；S2：将扩增后的CTLA-4产物片段与载体连接，得到连接液；S3：将连接液转入感受态细胞中，并提取重组质粒；S4：将重组质粒转染至宿主菌中，对抗原进行表达，并对表达的抗原蛋白进行纯化；S5：利用步骤S4中得到的抗原蛋白对驼类动物进行免疫；S6：采集免疫后的驼类动物外周血，分离淋巴细胞；S7：抽提淋巴细胞样品的总RNA，反转录为cDNA，使用引物CAL-leader和CAL-CH2进行扩增，得到VHH文库片段，其中引物CAL-leader和CAL-CH2的序列分别见SEQIDNO:4和SEQIDNO:5；S8：将VHH文库片段插入表达载体，并转化至感受态细胞中，构建抗体免疫库；S9：用生物素化方法筛选抗体免疫库中的纳米抗体；S10：验证筛选的纳米抗体与CTLA-4抗原结合。2.根据权利要求1所述的CTLA-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈创夫，吴鹏，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65