本发明专利技术涉及一种从澳大利亚甜羽扇豆粉中提取含量最高、强致敏性的致敏羽扇豆球蛋白‑β‑conglutin，以羽扇豆粉为原料，经过丙酮、Tris‑HCl、硫酸铵等试剂处理后，通过离心、阴离子交换层析和凝胶排阻层析，促进分离目标蛋白质，分离提纯获得纯度较高的目标物，采用SDS‑PAGE凝胶电泳对分离的蛋白质进行表征。基于此背景，为后续进一步探究蛋白性质、相应特异性抗体的生产及人类毒性的研究奠定基础。此方法可以选择性的分离目标过敏原并获得高纯度的蛋白质成分，有助于准确地确定羽扇豆浓度。除此之外，通过观察提取出的过敏原与相应血清中免疫球蛋白E的反应，可阐释过敏原的毒性特性并为进一步探测食品中羽扇豆过敏原所进行的分析实验提供关键信息。
A method for extracting beta-conglutin from Australian sweet lupin powder
【技术实现步骤摘要】
一种从澳大利亚甜羽扇豆粉中提取β-conglutin的方法
：本专利技术涉及生物材料
，尤其涉及一种羽扇豆球蛋白-β-conglutin提取方法。
技术介绍
：羽扇豆(学名：LupinusmicranthusGuss.)俗称鲁冰花，根据用途可将其分为食用型羽扇豆和观赏型羽扇豆。羽扇豆分布广且种类繁多，一般来说，栽培的羽扇豆一般分为5个种：窄叶羽扇豆，也被叫做澳大利亚甜羽扇豆、白羽扇豆，别名为埃及羽扇豆、黄羽扇豆、砂质平原羽扇豆和南美羽扇豆。近年来，羽扇豆作为具有高营养价值的优质食品材料而备受关注，其含有5.5％-10％油脂、11％-14％的膳食纤维、32％-36％的粗蛋白(食用羽扇豆的蛋白质更高)以及少量的淀粉和大量的多聚半乳糖。α-conglutin、β-conglutin、γ-conglutin和δ-conglutin四种羽扇豆球蛋白均可引起过敏反应，其中β-conglutin为羽扇豆球蛋白中含量最高的致敏原类羽扇豆球蛋白。国际免疫学会(IUIS)命名小组委员会近期指定β-conglutin命名为Lupan1过敏原，为羽扇豆产生过敏现象的主要物质。自1994年首次报道羽扇豆不良免疫反应病例以来，对羽扇豆的过敏反应越来越普遍。它可通过面粉，种子或粉尘的形式产生各种不同的过敏反应，轻微症状可能包括荨麻疹，或口腔刺痛或发痒。更严重的症状虽并不常见，但部分人仍有可能出现包括喉咙膨胀，呼吸困难，哮喘，腹痛，恶心和呕吐在内的一系列过敏性反应。此外，在极端情况下，血压会急剧下降(过敏性休克)，个体可能会变得虚弱进而导致昏迷。提取羽扇豆蛋白的方法有碱溶酸沉法和超滤。碱溶酸沉是目前工业上采取的最普遍的方法，但是这种方法可能会引起蛋白质变性，从而对营养价值产生一定的影响。并且目前暂无提取纯羽扇豆β-conglutin的成熟方法，因此建立一套成熟的羽扇豆β-conglutin纯蛋白的提取方法，并为后续进一步探究蛋白性质、相应特异性抗体的生产及人类毒性的研究奠定基础十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺点，提供一种高纯度、高得率、高性能的致敏羽扇豆球蛋白-β-conglutin的制备方法。本专利技术通过丙酮脱脂、粗提、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析法、凝胶排阻层析法进行提取，制备高纯度的致敏羽扇豆球蛋白-β-conglutin，为后续探究蛋白性质、相应特异性抗体的生产及人类毒性的研究奠定基础。与传统提取蛋白常用的碱溶酸沉法相比，该方法能有效防止蛋白发生变性，且纯度更高，并为后续实验的进行提供保障。为实现上述目的，本专利技术的检测方法概述如下：一种从澳大利亚甜羽扇豆粉中提取β-conglutin的方法，包括如下步骤：(1)丙酮脱脂将羽扇豆粉末和丙酮按1∶10(W/V)混合，借助磁力搅拌器在3～6℃冰箱中搅拌脱脂1～3h，之后用冷冻离心机在9000r/min3～6℃条件下离心10～20min，得到沉淀；所得沉淀反复脱脂3～5次，完成后，将沉淀放于通风橱中过夜风干丙酮，干后得脱脂的羽扇豆粉末；(2)盐析法粗提称量脱脂后的羽扇豆粉，按1g羽扇豆粉加入5mL50mmol/L含1.0mol/LNaCl的Tris-HCL缓冲液提取蛋白，搅拌均匀后放置在3～6℃冰箱中磁力搅拌过夜，提完后3～6℃条件下在离心机中10000～12000r/min离心15～30min，羽扇豆过敏原粗提液为离心所得的上清液；(3)硫酸铵分级沉淀按每100mL上清液加入76.7g硫酸铵提取，提取3～5h后10000～12000r/min离心15～30min，弃去上清，得到白色沉淀即为粗蛋白；(4)阴离子交换层析法分离纯化将步骤(3)得到粗蛋白溶于PBS溶液装于透析袋中，封好后，放置在3～6℃冰箱中借助磁力搅拌装置在1×PBS溶液中透析2～3天，每隔3～4h换液一次；完成透析后将所得溶液取出放于30kDa超滤离心管中以7000～9000r/min超滤离心15～30min；选取DEAE–Sepharose为填料，取出100g后利用循环水真空泵进行抽滤，完成后将所得固体溶于蒸馏水中再进行抽滤，重复水洗抽干三次以保证除去乙醇；用蒸馏水冲洗柱子末端以排除死腔中的气体，关闭柱子出口，并使柱子里含有2-3厘米高度的蒸馏水；将匀浆连续倒入层析柱中并一边沉降一边用洗耳球轻轻敲打，使填料装填紧实；待胶床稳定后，打开层析柱底端出口，使液体流出，用蒸馏水冲洗5～7次，用Tris–HCl缓冲液冲洗两次，最后用Tris–HCl缓冲液封柱；将所得蛋白浸提液解冻过滤后，上样至已用Tris–HCl缓冲液平衡完全的DEAE–SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱中，配制含有NaCl的Tris–HCl缓冲液并用其进行梯度洗脱，缓冲液使用前超声处理15～30min，流速为1.5mL/min，待蛋白浓度在20～30min稳定后再更换不同浓度洗脱液，收集各个洗脱峰，得到粗β-conglutin，每管收集7.5mL，做定性检测；(5)凝胶排阻层析法将上步所得含有过敏原β-conglutin的洗脱峰溶液浓缩，上样至已用Tris-HCl缓冲液平衡完全的Superdex200pg凝胶排阻层析柱中(填柱方式与阴离子交换层析柱相同)，上样完毕后，再用Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为0.2mL/min，收集各个洗脱峰溶液，得到更纯的β-conglutin。每管收集4mL，再进行电泳检测。优选的，所用的DEAE–Sepharose使用20％乙醇贮存；所用的Tris-HCL缓冲液浓度为50mmol/L，pH8.0。优选的，所述不同浓度洗脱液分别为含0.1MNaCl的Tris-HCl溶液、含0.2MNaCl的Tris-HCl溶液、含0.3MNaCl的Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl浓度均为50mM。按本专利技术方法得到的β-conglutin的检测方法，(1)SDS–PAGE电泳检测装好电泳仪后，在灌胶模具中每板加入7mL分离胶，再在胶上缓缓加入1mL蒸馏水，40min待分离胶凝固后，倒去上方蒸馏水，在已凝固成型的分离胶上加入2mL浓缩胶，插入梳子，过程要避免有气泡产生，待浓缩胶凝固后，拔去梳子；将10μL5×SDS-PAGE上样缓冲液加入到40μL步骤4得到的粗蛋白，借助泡沫浮板将混合样品放置在大烧杯中沸水浴5min，离心30s，然后用上样针吸取处理后样品注入梳孔中，将蛋白Marker同时加入作为参比；将500mL电泳缓冲液加入到电泳槽中，首先设置恒流压80v，待溴酚蓝指示剂进入分离胶，15min后将电压调至120v，恒流至溴酚蓝距分离胶底端0.5cm左右时停止电泳；关闭电泳仪，将电泳胶从玻璃板上剥离并置于塑料平皿中，加入考马斯亮蓝R250染色后放置在摇床震荡染色20min，染色后倒出染色液，用考马斯亮蓝脱色液将胶用脱色至蛋白质条带清晰；脱色完成后，将电泳凝胶取出用SageCapture软件灰度扫描在电脑中成像并分析蛋白纯度；(2)采用BCA法测定提纯羽扇豆蛋白浓度利用在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+与BCA试剂形成紫蓝色的络合物的特性，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，然后即可计算出待测蛋白的浓度；首先根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从澳大利亚甜羽扇豆粉中提取β‑conglutin的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)丙酮脱脂将羽扇豆粉末和丙酮按1∶10(W/V)混合，借助磁力搅拌器在3～6℃冰箱中搅拌脱脂1～3h，之后用冷冻离心机在9000r/min3～6℃条件下离心10～20min，得到沉淀；所得沉淀反复脱脂3～5次，完成后，将沉淀放于通风橱中过夜风干丙酮，干后得脱脂的羽扇豆粉末；(2)盐析法粗提称量脱脂后的羽扇豆粉，按1g羽扇豆粉加入5mL 50mmol/L含1.0mol/L NaCl的Tris‑HCL缓冲液提取蛋白，搅拌均匀后放置在3～6℃冰箱中磁力搅拌过夜，提完后3～6℃条件下在离心机中10000～12000r/min离心15～30min，羽扇豆过敏原粗提液为离心所得的上清液；(3)硫酸铵分级沉淀按每100mL上清液加入76.7g硫酸铵提取，提取3～5h后10000～12000r/min离心15～30min，弃去上清，得到白色沉淀即为粗蛋白；(4)阴离子交换层析法分离纯化将步骤(3)得到粗蛋白溶于PBS溶液装于透析袋中，封好后，放置在3～6℃冰箱中借助磁力搅拌装置在1×PBS溶液中透析2～3天，每隔3～4h换液一次；完成透析后将所得溶液取出放于30kDa超滤离心管中以7000～9000r/min超滤离心15～30min；选取DEAE–Sepharose为填料，取出100g后利用循环水真空泵进行抽滤，完成后将所得固体溶于蒸馏水中再进行抽滤，重复水洗抽干三次以保证除去乙醇；用蒸馏水冲洗柱子末端以排除死腔中的气体，关闭柱子出口，并使柱子里含有2‑3厘米高度的蒸馏水；将匀浆连续倒入层析柱中并一边沉降一边用洗耳球轻轻敲打，使填料装填紧实；待胶床稳定后，打开层析柱底端出口，使液体流出，用蒸馏水冲洗5～7次，用Tris–HCl缓冲液冲洗两次，最后用Tris–HCl缓冲液封柱；将所得蛋白浸提液解冻过滤后，上样至已用Tris–HCl缓冲液平衡完全的DEAE–Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱中，配制含有NaCl的Tris–HCl缓冲液并用其进行梯度洗脱，缓冲液使用前超声处理15～30min，流速为1.5mL/min，待蛋白浓度在20～30min稳定后再更换不同浓度洗脱液，收集各个洗脱峰，得到粗β‑conglutin；(5)凝胶排阻层析法将上步所得含有过敏原β‑conglutin的洗脱峰溶液浓缩，上样至已用Tris‑HCl缓冲液平衡完全的Superdex 200pg凝胶排阻层析柱中，上样完毕后，再用Tris‑HCl缓冲液洗脱，流速为0.2mL/min，收集各个洗脱峰溶液，得到更纯的β‑conglutin。...
【技术特征摘要】
1.一种从澳大利亚甜羽扇豆粉中提取β-conglutin的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)丙酮脱脂将羽扇豆粉末和丙酮按1∶10(W/V)混合，借助磁力搅拌器在3～6℃冰箱中搅拌脱脂1～3h，之后用冷冻离心机在9000r/min3～6℃条件下离心10～20min，得到沉淀；所得沉淀反复脱脂3～5次，完成后，将沉淀放于通风橱中过夜风干丙酮，干后得脱脂的羽扇豆粉末；(2)盐析法粗提称量脱脂后的羽扇豆粉，按1g羽扇豆粉加入5mL50mmol/L含1.0mol/LNaCl的Tris-HCL缓冲液提取蛋白，搅拌均匀后放置在3～6℃冰箱中磁力搅拌过夜，提完后3～6℃条件下在离心机中10000～12000r/min离心15～30min，羽扇豆过敏原粗提液为离心所得的上清液；(3)硫酸铵分级沉淀按每100mL上清液加入76.7g硫酸铵提取，提取3～5h后10000～12000r/min离心15～30min，弃去上清，得到白色沉淀即为粗蛋白；(4)阴离子交换层析法分离纯化将步骤(3)得到粗蛋白溶于PBS溶液装于透析袋中，封好后，放置在3～6℃冰箱中借助磁力搅拌装置在1×PBS溶液中透析2～3天，每隔3～4h换液一次；完成透析后将所得溶液取出放于30kDa超滤离心管中以7000～9000r/min超滤离心15～30min；选取DEAE–Sepharose为填料，取出100g后利用循环水真空泵进行抽滤，完成后将所得固体溶于蒸馏水中再进行抽滤，重复水洗抽干三次以保证除去乙醇；用蒸馏水冲洗柱子末端以排除死腔中的气体，关闭柱子出口，并使柱子里含有2-3厘米高度的蒸馏水；将匀浆连续倒入层析柱中并一边沉降一边用洗耳球轻轻敲打，使填料装填紧实；待胶床稳定后，打开层析柱底端出口，使液体流出，用蒸馏水冲洗5～7次，用Tris–HCl缓冲液冲洗两次，最后用Tris–HCl缓冲液封柱；将所得蛋白浸提液解冻过滤后，上样至已用Tris–HCl缓冲液平衡完全的DEAE–SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱中，配制含有NaCl的Tris–HCl缓冲液并用其进行梯度洗脱，缓冲液使用前超声处理15～30min，流速为1.5mL/min，待蛋白浓度在20～30min稳定后再更换不同浓度洗脱液，收集各个洗脱峰，得到粗β-conglutin；(5)凝胶排阻层析法将上步所得含有过敏原β-conglutin的洗脱峰溶液浓缩，上样至已用Tris-HCl缓冲液平衡完全的Superdex200pg凝胶排阻层析柱中，上样完毕后，再用Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为0.2mL/min，收集各个洗脱峰溶液，得到更纯的β-conglutin。2.根据权利要求1所述一种从澳大利亚甜羽扇豆粉中提取β-conglutin的方法，其特征在于，所用的DEAE–Sepharose使用20％乙醇贮存；所用的Tris-HCL缓冲液浓度为50mmol/L，pH8.0。3.根据权利要求1所述一种从澳大利亚甜羽扇豆粉中提取β-conglutin的方法，其特征在于，所述不同浓度洗脱液分别为含0.1MNaCl的Tris-HCl溶液、含0.2MNaCl的Tris-HCl溶液、含...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆旸，张咏，王黔，王硕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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