一种抗氧化肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗氧化肽及其应用，属于生物技术领域。所述抗氧化肽为含Cys残基的肽段，分子量为700‑800Da。所述抗氧化肽应用于保健品、食品添加剂或化妆品。本发明专利技术通过清除DPPH·自由基、ABTS·

An Antioxidant Peptide and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种抗氧化肽及其应用
本专利技术涉及一种抗氧化肽及其应用，属于生物

技术介绍
生物活性肽，是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，具调节机体新陈代谢、参与生命活动的物质。具有抗氧化活性的生物活性肽又被称为抗氧化肽。人体内如癌症、风湿、动脉粥样硬化等许多慢性疾病的发生，与机体自由基氧化损伤有很大的关系。在正常的生理环境中，机体都会产生少量的活性氧自由基(ROS)，机体内的抗氧化体系(包括抗氧化酶和非酶类抗氧化剂)能快速清除过量自由基，以维持其生理适宜浓度。但在受到氧化损伤时，自由基累积过多，会发生氧化应激反应。因此，人体适量摄入抗氧化剂能有效预防氧化应激，维持体内自由基平衡。抗氧化活性的检测方法有很多，但目前尚缺乏统一的抗氧化评价指标体系。生物体内自由基种类繁多，抗氧化肽的抗氧化活性与其肽段的分子量大小、氨基酸组成以及氨基酸序列顺序等因素密切相关，即使是相同结构的抗氧化肽在不同自由基的反应介质中，表现出来的抗氧化活性也不同。因此，单一的抗氧化指标不能科学的评价生物活性肽的抗氧化活性，需要采用多种指标联合评价抗氧化肽体外抗氧化活性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题，在于提供一种抗氧化肽及其应用，通过综合评价抗氧化活性，得到抗氧化活性较好的抗氧化肽。本专利技术是这样实现的：本专利技术首先提供了一种抗氧化肽，所述抗氧化肽为含Cys残基的肽段，分子量为700-800Da。优选地，所述抗氧化肽的氨基酸序列为ThrIleAspCysAspArg。本专利技术还提供了所述抗氧化肽的用途，即应用于保健品、食品添加剂或化妆品。本专利技术具有如下优点：通过清除DPPH·自由基、ABTS·+自由基，还原力和亚油酸自氧化抑制率四个指标对抗氧化肽进行抗氧化活性进行综合评价。结果表明，在清除DPPH·自由基和还原力中，含有Cys的肽段具有明显活性，其余肽段均清除DPPH·自由基活性和还原能力很弱；在ABTS·+自由基中，含有Cys的肽段也具有一定的清除ABTS·+自由基的能力，其余不含Cys和Tyr的肽段均活性很弱；在抑制亚油酸自氧化中，含有Cys的肽段均表现出抑制亚油酸自氧化能力。在细胞抗氧化研究中，TIDCDR能不同程度的上调细胞内GSH-Px、CAT、SOD抗氧化酶活性，降低细胞上清液LDH漏出和细胞内MDA含量。附图说明下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的说明。图1为抗氧化肽对DPPH·的清除作用。图2为抗氧化肽还原力。图3为抗氧化肽清除ABTS·+活性。图4为抗氧化肽对亚油酸自氧化的抑制。图5为抗氧化肽对LO2细胞H2O2氧化损伤的保护作用。图6为抗氧化肽对LDH活力的影响。图7为抗氧化肽对细胞MDA生成量的影响。图8为抗氧化肽对细胞内GSH-Px活力的影响。图9为抗氧化肽对细胞内CAT活力的影响。图10为抗氧化肽对内SOD活力的影响。具体实施方式一、鲍内脏蛋白酶解、分离纯化与肽段的氨基酸序列分析1、方法鲍内脏→酶解→酶解液→截留分子量30000Da超滤膜超滤→截留分子量200Da纳滤膜浓缩→冻干→酶解产物→SephadexG-15分离→HW-40f中压柱分离→半制备反相高效液相(RP-HPLC)分离纯化→ESI-LCMS结构分析。具体如下：(1)以鲍内脏为底物，分别选择木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶的酶解条件为料液比1:20g/mL、加酶量2500U/g、酶解温度45℃、pH8.0；碱性蛋白酶酶解条件为料液比1:30g/mL、加酶量3000U/g、酶解温度55℃、pH9.5；中性蛋白酶酶解条件为料液比1:30g/mL、加酶量3000U/g、酶解温度55℃、pH7.5；木瓜蛋白酶酶解条件为料液比1:30g/mL、加酶量3000U/g、酶解温度60℃、pH6.5，此条件下酶解3h，原料中蛋白质水解度分别为18.21±0.71、15.98±0.21、25.14±0.42和18.67±0.32％。酶解液经截留分子量30000Da超滤膜超滤、截留分子量200Da纳滤膜浓缩，冻干得鲍内脏酶解物。(2)SephadexG-15分离：SephadexG-15凝胶色谱柱规格为洗脱条件为：上样溶度50mg/mL，上样量2mL，超纯水为流动相，流速24mL/h，每10min收集一管，220nm检测，记录并绘制吸光度曲线，收集各洗脱峰，冷冻干燥各洗脱组分。(3)HW-40f中压柱分离：HW-40f填料凝胶色谱中压玻璃柱型号为洗脱条件为:上样溶度，上样量2mL，超纯水为流动相，流速2mL/min，柱压<3bar，220nm检测，记录并绘制吸光度曲线，收集各洗脱峰，冷冻干燥各洗脱组分。(4)半制备反相高效液相(RP-HPLC)分离纯化：采用GreenODS-2C18P/N84176(5um，120A)色谱柱。流速2mg/min，溶度10mg/ml，进样量1ml，柱温为30℃，检测波长220nm，流动相：A-超纯水(体积分数0.05％TFA)，B-乙腈(体积分数0.05％TFA)；洗脱条件：0～30min：95％A+5％B～60％A+40％B；30～40min：5％A+95％B。2、结果(1)经SephadexG-15凝胶色谱柱和HW-40f中压制备柱分离得到12个鲍内脏蛋白肽组分，分别为胰蛋白酶组分：AVH-TA、AVH-TD、AVH-TE；碱性蛋白酶组分：AVH-AA、AVH-AD、AVH-AE；中性蛋白酶组分：AVH-NA、AVH-ND、AVH-NE；木瓜蛋白酶组分：AVH-PA、AVH-PD、AVH-PE(大分子量肽组分A、中等分子量肽组分D和小分子量肽组分E)，结果发现小分子量肽组分E抗氧化能力均显著高于肽组分A和肽组分D。AVH-TE，AVH-AE，AVH-NE和AVH-PE清除DPPH·自由基IC50分别为0.832、1.935、1.793和1.138mg/mL，还原力ECA700nm＝0.5分别为2.176，3.464，2.107和1.987mg/mL，亚油酸抑制率分别为90.4±4.88，89.8±1.20，90.2±6.77和89.9±1.4％。(2)使用半制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离小分子组分AVH-TE、AVH-AE、AVH-NE和AVH-PE，共得到8个主要组分，分别为AVH-TE-1、AVH-TE-2、AVH-AE-1、AVH-AE-2、AVH-NE-1、AVH-NE-2、AVH-PE-1和AVH-NE-2。(3)对AVH-TE-1、AVH-TE-2、AVH-AE-1、AVH-AE-2、AVH-NE-1、AVH-NE-2、AVH-PE-1和AVH-NE-2进行氨基酸序列分析，得到16个肽目标肽段，分别为METY，YHGF，QCVR，QSCARF，AAPAVSGR，NRFGVSR，PVPPYKA，AAQYSRN，VHAEPTK，GCYVPKC，NSHVVR，AANNSTR，TIDCDR，CIGYDR，DDITRD，DVAFMR，如表1所示。表1抗氧化肽序列与分子量注：平均亲水性值>2，说明肽的溶解性非常的好，即使短暂与空气接触，也有可能吸潮；0<平均亲水性值为≤2，说明肽在水中溶解性很好，无需添加助溶剂亦可取得较好的溶解效果；-2<平均亲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗氧化肽，其特征在于：所述抗氧化肽为含Cys残基的肽段，分子量为700‑800Da。

【技术特征摘要】
1.一种抗氧化肽，其特征在于：所述抗氧化肽为含Cys残基的肽段，分子量为700-800Da。2.根据权利要求1所述的抗氧化肽，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊何健，杨佳洪，马英，何传波，魏好程，吴国宏，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建,35