一株猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用，属于猪的免疫预防技术领域，所述猪德尔塔冠状病毒毒株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.17383。所述猪德尔塔冠状病毒毒株的毒性强；将所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活后制备猪流行性腹泻病毒，免疫效果好。

A swine delta coronavirus strain and its application

【技术实现步骤摘要】
一株猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用
本专利技术属于猪的免疫预防
，尤其涉及一种猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用。
技术介绍
猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus,PDCoV)是冠状病毒科δ冠状病毒属的一个新成员，能造成母猪和仔猪的腹泻、呕吐、脱水，严重可致死，给养猪场及养殖业造成了严重的经济损失。2012年，该新型冠状病毒在中国香港被首次发现。2014年初，美国俄亥俄州的猪场爆发了母猪和仔猪腹泻病，经检测为PDCoV阳性，并且在美国的至少18个州中也相继检测到了该新型猪冠状病毒。随后，在韩国以及加拿大的腹泻仔猪的粪便样品中也检测到了PDCoV。在中国，2013年～2014年，对从江苏、广东、安徽、湖北、河南等省市的养猪场中采集的258份粪便样本进行检测后发现，PDCoV阳性率达到14.3％，首次证实在中国内地存在PDCoV。2015年至今，在我国其他省市，如陕西、甘肃、浙江、河北、天津等地区也陆续检测到PDCoV。目前，由PDCoV所致的猪腹泻疾病呈世界流行和逐渐扩散的趋势。与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)相同，PDCoV也是引起猪腹泻疾病的常见病原之一。该病毒对不同日龄的猪均可致病，对仔猪有较强的致病性，表现为持续腹泻、呕吐，严重时会因脱水致死，病死率一般为30％～40％。但PDCoV是一种近年来刚刚发现的新型病原，目前在世界范围内尚未研制出针对该病的有效疫苗或药物。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于一种猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用；所述猪德尔塔冠状病毒毒株免疫保护效果好，能够用于制备疫苗。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种猪德尔塔冠状病毒毒株，所述猪德尔塔冠状病毒毒株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.17383。本专利技术提供了包括所述的猪德尔塔冠状病毒毒株S基因组的重组载体。本专利技术提供了所述猪德尔塔冠状病毒毒株在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。优选的，所述猪流行性腹泻疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗。优选的，所述灭活疫苗包括灭活的所述猪德尔塔冠状病毒和辅助剂。本专利技术提供了所述的重组载体在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。优选的，所述猪流行性腹泻疫苗包括亚单位疫苗。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的猪德尔塔冠状病毒毒株，在侵染细胞第一代就出现了典型致细胞病变效应CPE，毒性强；将所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活后制备猪流行性腹泻病毒，免疫效果好。根据本专利技术实施例记载，用所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活疫苗免疫仔猪，在免疫后7天即可引起IgG抗体的显著升高，并在免疫后14、21天持续升高，且抗体水平显著高于阴性对照组(PBS)；进一步地攻毒保护试验结果显示，所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活苗能够保护4/5的仔猪抵抗100个TCID50同源毒株的攻击，而阴性对照组则全部发病(0/5保护)，可见所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活苗免疫效果好。附图说明图1为所述猪德尔塔冠状病毒毒株70代CPE的显微镜图片；图2为所述猪德尔塔冠状病毒毒株的系统进化树；图3为所述猪德尔塔冠状病毒毒株的生长曲线；图4为所述猪德尔塔冠状病毒毒株的IFA鉴定图；图5为所述猪德尔塔冠状病毒毒株的病毒粒子形态图；图6为所述猪德尔塔冠状病毒毒株的致病性分析，其中A为临床特征图，B为剖检病变图；图7为感染所述猪德尔塔冠状病毒毒株后仔猪的肠道病理变化的组织病理观察图；图8为用所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活疫苗免疫仔猪后的IgG抗体水平。生物保藏说明本专利技术提供的猪德尔塔冠状病毒CH/XJYN03/2016于2019年02月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.17383。具体实施方式本专利技术提供了一种猪德尔塔冠状病毒毒株，所述猪德尔塔冠状病毒毒株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.17383。本专利技术中，所述猪德尔塔冠状病毒毒株分离自中国新疆，所述猪德尔塔冠状病毒毒株与其它PDCoV参考毒株在处于同一个分支，并且亲缘关系相近，同属δ冠状病毒属；而与α冠状病毒属的TGEV和PEDV差异性较大，不在同一分支。本专利技术中，所述猪德尔塔冠状病毒粒子形状大致呈椭圆形，直径约100nm左右，四周有明显的似皇冠状的纤突，为冠状病毒的典型特征。本专利技术将所述猪德尔塔冠状病毒毒株阳性样品接种Vero细胞传代培进行传代培养，所述猪德尔塔冠状病毒毒株在第一代就出现了典型CPE；本专利技术中，所述猪德尔塔冠状病毒毒株P0代和P20代毒价分别为104.65TCID50/mL和105.57TCID50/mL。本专利技术提供了包括所述的猪德尔塔冠状病毒毒株S基因组的重组载体。在本专利技术中，所述猪德尔塔冠状病毒毒株S基因组优选的通过以下方法制备获得：A)提取包括所述猪德尔塔冠状病毒毒株的样品的总RNA；B)利用S基因组特异性引物，以所述总RNA为模板进行RT-PCR反应获得所述猪德尔塔冠状病毒毒株S基因组。在本专利技术中，包括所述猪德尔塔冠状病毒毒株的样品优选为田间粪便样品或细胞培养病毒液；本专利技术中，所述总RNA的提取的方法采用本领域常规的病毒总RNA提取方法，无其他特殊要求。本专利技术中，所述S基因组特异性引物包括A片段引物对、B片段引物对和C片段引物对；所述A片段引物对、B片段引物对和C片段引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：1～6所示。本专利技术中，所述RT-PCR反应优选的采用GXLDNAPolymerase试剂盒进行；所述RT-PCR反应的扩增体系以50μL计，优选的包括如下组分：所述RT-PCR反应的扩增程序优选的如下：98℃1min；95℃30s，60℃40s，68℃1min，34个循环；68℃1min；4℃保存。本专利技术中，所述RT-PCR扩增反应的产物即为所述猪德尔塔冠状病毒毒株S基因组。在本专利技术中，优选的将所述RT-PCR扩增产物与载体链接获得重组载体。在本专利技术中，所述载体以及连接方法采用本领域常规载体及连接方法即可，无其他特殊要求。在本专利技术具体实施过程中，所述载体优选为平末端连接载体pCR-XL-2TOPO载体。本专利技术中所述重组载体能够用于所述猪德尔塔冠状病毒S基因组的克隆和鉴定；所述重组载体还能够用于亚单位疫苗的制备。本专利技术还提供了所述猪德尔塔冠状病毒毒株在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。在本专利技术中，所述猪流行性腹泻疫苗优选包括灭活疫苗和减毒疫苗；所述灭活疫苗优选的包括灭活的所述猪德尔塔冠状病毒和辅助剂；本专利技术对所述辅助剂的种类和用量没有特殊限定，采用本领域常规的疫苗辅助剂即可。本专利技术中，所述减毒疫苗优选的通过对所述猪德尔塔冠状病毒毒进行减毒获得；所述减毒的方法采用本领域常规的病毒减毒方法即可。本专利技术还提供了所述的重组载体在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。本专利技术中，所述猪流行性腹泻疫苗优选的包括亚单位疫苗，更优选为基因工程亚单位疫苗。本专利技术对所述疫苗的制备方法没有特殊要求，采用本领域常规的疫苗制备方法即可。下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例11病料与细胞病料采集自中国新疆，12份含有PDCoV阳性毒株的样品用于PDCoV的分离鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪德尔塔冠状病毒毒株，其特征在于，所述猪德尔塔冠状病毒毒株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.17383。

【技术特征摘要】
1.一种猪德尔塔冠状病毒毒株，其特征在于，所述猪德尔塔冠状病毒毒株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.17383。2.包括权利要求1所述的猪德尔塔冠状病毒毒株S基因组的重组载体。3.权利要求1所述猪德尔塔冠状病毒毒株在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。4.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘新生，王永录，方玉珍，周鹏，张永光，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62