一种非核糖体脂肪多肽的制备方法技术

一种非核糖体脂肪多肽的制备方法。该方法合成工艺简单，原料易得，多肽类型选择灵活。利用该方法制备得到了高纯度、高产率的非核糖体脂肪七肽Lipovelutibols A，可商业规模化生产，具有很好的应用前景。

A Method for Preparing Non-Ribosome Fatty Peptides

【技术实现步骤摘要】
一种非核糖体脂肪多肽的制备方法
本专利技术涉及药物合成领域，尤其涉及一种非核糖体脂肪多肽的制备方法。
技术介绍
LipovelutibolsA是从生长于喜马拉雅寒冷栖息地土壤中的木霉属丝状变形真菌Trichodermavelutinum中分离得到的一种新型非核糖体脂肪肽。其含有一个特殊氨基酸Aib，且N端辛酰化，C端为L-亮氨醇。LipovelutibolsA的氨基酸序列如下：辛酰基-(L-甘氨酸)-(L-丙氨酸)-(L-亮氨酸)-(2-氨基异丁酸)-(L-丝氨酸)-(L-异亮氨酸)-(L-亮氨醇)，即Octanoyl-Gly-Ala-Leu-Aib-Ser-Ile-Leucinol，其分子量为770.54。细胞实验表明，LipovelutibolsA对HL-60(人白血病细胞)、LS180(结肠癌细胞)、MDA-MB-231(乳腺癌细胞)和A549(肺癌细胞))多个肿瘤细胞系均可达到微摩尔级的抑制毒性，具有潜在的临床应用价值。但目前LipovelutibolsA只能从木霉属丝状变形真菌Trichodermavelutinum中分离得到，提取效率低，且菌株较为稀少，难以获得，很难满足对其药理活性进一步研究的需要。因此，亟需一种高效、简便、高纯度、高产率的合成LipovelutibolsA的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效、简便、高纯度、高产率的合成LipovelutibolsA的方法。本专利技术提供了一种非核糖体脂肪多肽的制备方法，包括以下步骤：(1)以端氨基的树脂固相载体、N-芴甲氧羰基保护的氨基酸为原料，在缩合剂的作用下进行偶联反应，得到端芴甲氧羰基树脂中间体1；(2)将端芴甲氧羰基树脂中间体1在脱保护剂的作用下，进行脱保护反应，得到端氨基树脂中间体2；(3)以端氨基树脂中间体2、N-芴甲氧羰基保护的氨基酸为原料，重复步骤(1)和(2)的偶联、脱保护反应，得到具有更长肽链的端氨基树脂中间体3；(4)以端氨基树脂中间体3、脂肪酸为原料，重复步骤(1)的偶联反应，得到树脂中间体4；(5)使用切割试剂将树脂中间体4上的肽链切割下来，得切割肽链，分离提纯，得到目标非核糖体脂肪多肽；或，使用切割试剂将树脂中间体4上的肽链切割下来，得切割肽链，然后在还原剂的作用下，将切割肽链上的端羧基还原为端羟基，分离提纯，得到目标非核糖体脂肪多肽。进一步地，步骤(1)中，所述端氨基的树脂固相载体是由以下方法制备的：以端芴甲氧羰基的树脂固相载体为原料，在脱保护剂的作用下，脱保护，得到端氨基的树脂固相载体。进一步地，所述端芴甲氧羰基的树脂固相载体为Fmoc-Leu-Wang树脂；和/或，所述脱保护剂为2-肟氰乙酸乙酯、哌啶、N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液；所述混合溶液中2-肟氰乙酸乙酯浓度为0.1M，哌啶浓度为20％；所述脱保护反应时间是5～20min，优选10min；所述脱保护反应温度为20～30℃，优选为25℃。进一步地，步骤(1)中，所述端氨基的树脂固相载体的载样量为0.33mmol/g，端氨基的树脂固相载体、N-芴甲氧羰基保护的氨基酸的质量摩尔比为500：(0.9～1.1)mg/mmol，优选为500：1mg/mmol；所述缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺和2-肟氰乙酸乙酯；N-芴甲氧羰基保护的氨基酸、2-肟氰乙酸乙酯、N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1：(0.9～1.1)：(0.9～1.1),优选为1：1：1；和/或，所述偶联反应温度为50～70℃，优选为60℃；所述偶联反应时间为15-30min，优选为20min。进一步地，步骤(2)中，所述脱保护剂为2-肟氰乙酸乙酯和哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的混合溶液；所述混合溶液中2-肟氰乙酸乙酯浓度为0.1M，哌啶浓度为20％；和/或，所述脱保护反应时间是5～20min，优选10min；所述脱保护反应温度为20～30℃，优选为25℃。进一步地，步骤(1)、(3)中，所述N-芴甲氧羰基保护的氨基酸各自独立地选自Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH中的一种或多种；和/或，步骤(4)中，所述脂肪酸选自C2-10脂肪酸。进一步地，步骤(1)中，所述N-芴甲氧羰基保护的氨基酸为Fmoc-Ile-OH；步骤(3)中，重复步骤(1)和(2)的次数为5次，每次使用的N-芴甲氧羰基保护的氨基酸依次为Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH；步骤(4)中，所述脂肪酸为正辛酸。进一步地，步骤(5)中，所述还原剂选自硼氢化钠、氯甲酸丁酯、N-甲基吗啉的混合体系，溶剂为四氢呋喃，其中硼氢化钠、氯甲酸丁酯、N-甲基吗啉、切割肽链的摩尔比为3:1:1:1；和/或，所述还原反应时间为3.5～4.5h，优选为4h；所述还原反应温度为-20～-10℃，优选为-15℃。进一步地，步骤(5)中，所述切割试剂为三异丙基硅烷、水、三氟乙酸的混合溶液，其中三异丙基硅烷、水、三氟乙酸的体积比为(1～2)：(1～2)：(75～80)，优选为1：1：38；所述Fmoc-Leu-Wang树脂与切割试剂的质量体积比为(20～40)：1mg/mL，优选为33.3：1mg/mL；和/或，所述切割的温度为20～30℃，优选为25℃；和/或，所述切割的时间为3.5～4.5h，优选为4h；和/或，所述分离提纯方法是：将所述切割肽链溶解于乙腈和水混合溶剂中，用反向高效液相色谱法纯化。进一步地，所述反向高效液相色谱法采用的色谱柱为YMC-PackODS-AQ柱；流动相A是三氟乙酸体积分数0.1％的水溶液，流动相B是三氟乙酸体积分数0.1％的乙腈溶液；梯度洗脱程序为40％～90％流动相B洗脱0～60min；流速为15mL/min，进样量为5mL,检测波长为214nm。综上，本专利技术提供了一种非核糖体脂肪多肽，特别是非核糖体脂肪七肽LipovelutibolsA的化学合成方法，该方法合成工艺简单，原料易得，多肽类型选择灵活，最终制备得到了高纯度、高产率的LipovelutibolsA，可商业规模化生产，应用前景良好。本文中，Fmoc-Ile-OH为N-芴甲氧羰基保护的L-异亮氨酸；Fmoc-Ser-OH为N-芴甲氧羰基保护的L-丝氨酸、Fmoc-Aib-OH为N-芴甲氧羰基保护的2-氨基异丁酸、Fmoc-Leu-OH为N-芴甲氧羰基保护的L-亮氨酸、Fmoc-Ala-OH为N-芴甲氧羰基保护的L-丙氨酸、Fmoc-Gly-OH为N-芴甲氧羰基保护的L-甘氨酸；Fmoc是芴甲氧羰基。本文中C2-10脂肪酸包括所有含2-10个碳原子的脂肪酸。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1：本专利技术制备LipovelutibolsA的路线图，其中“protectedpeptide”表示F本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非核糖体脂肪多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)以端氨基的树脂固相载体、N‑芴甲氧羰基保护的氨基酸为原料，在缩合剂的作用下进行偶联反应，得到端芴甲氧羰基树脂中间体1；(2)将端芴甲氧羰基树脂中间体1在脱保护剂的作用下，进行脱保护反应，得到端氨基树脂中间体2；(3)以端氨基树脂中间体2、N‑芴甲氧羰基保护的氨基酸为原料，重复步骤(1)和(2)的偶联、脱保护反应，得到具有更长肽链的端氨基树脂中间体3；(4)以端氨基树脂中间体3、脂肪酸为原料，重复步骤(1)的偶联反应，得到树脂中间体4；(5)使用切割试剂将树脂中间体4上的肽链切割下来，得切割肽链，分离提纯，得到目标非核糖体脂肪多肽；或，使用切割试剂将树脂中间体4上的肽链切割下来，得切割肽链，然后在还原剂的作用下，将切割肽链上的端羧基还原为端羟基，分离提纯，得到目标非核糖体脂肪多肽。

【技术特征摘要】
1.一种非核糖体脂肪多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)以端氨基的树脂固相载体、N-芴甲氧羰基保护的氨基酸为原料，在缩合剂的作用下进行偶联反应，得到端芴甲氧羰基树脂中间体1；(2)将端芴甲氧羰基树脂中间体1在脱保护剂的作用下，进行脱保护反应，得到端氨基树脂中间体2；(3)以端氨基树脂中间体2、N-芴甲氧羰基保护的氨基酸为原料，重复步骤(1)和(2)的偶联、脱保护反应，得到具有更长肽链的端氨基树脂中间体3；(4)以端氨基树脂中间体3、脂肪酸为原料，重复步骤(1)的偶联反应，得到树脂中间体4；(5)使用切割试剂将树脂中间体4上的肽链切割下来，得切割肽链，分离提纯，得到目标非核糖体脂肪多肽；或，使用切割试剂将树脂中间体4上的肽链切割下来，得切割肽链，然后在还原剂的作用下，将切割肽链上的端羧基还原为端羟基，分离提纯，得到目标非核糖体脂肪多肽。2.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述端氨基的树脂固相载体是由以下方法制备的：以端芴甲氧羰基的树脂固相载体为原料，在脱保护剂的作用下，脱保护，得到端氨基的树脂固相载体。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述端芴甲氧羰基的树脂固相载体为Fmoc-Leu-Wang树脂；和/或，所述脱保护剂为2-肟氰乙酸乙酯、哌啶、N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液；所述混合溶液中2-肟氰乙酸乙酯浓度为0.1M，哌啶浓度为20％；所述脱保护反应时间是5～20min，优选10min；所述脱保护反应温度为20～30℃，优选为25℃。4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述端氨基的树脂固相载体的载样量为0.33mmol/g，端氨基的树脂固相载体、N-芴甲氧羰基保护的氨基酸的质量摩尔比为500：(0.9～1.1)mg/mmol，优选为500：1mg/mmol；所述缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺和2-肟氰乙酸乙酯；N-芴甲氧羰基保护的氨基酸、2-肟氰乙酸乙酯、N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1：(0.9～1.1)：(0.9～1.1),优选为1：1：1；和/或，所述偶联反应温度为50～70℃，优选为60℃；所述偶联反应时间为15-30min，优选为20min。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述脱保护剂为2-肟氰乙酸乙酯和哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的混合溶液；所述混合溶液中2-肟...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖洪利，刘泰容，吴也，莫金秋，苏春丽，胡雪梅，廖秀飞，
申请(专利权)人：成都医学院，
类型：发明
国别省市：四川,51