一种测定工业用纤维素酶酶活力的方法技术

本发明专利技术涉及酶工程领域，具体涉及一种测定工业用纤维素酶酶活力的方法。本发明专利技术评估工业用纤维素酶酶活的方法，包括下列步骤：试剂及材料准备；制作标准曲线；纤维素酶样品处理；设置实验组和对照组，分别加入纤维素酶底物和纤维素酶样品；进行酶解反应；以对照组为空白对照，测试反应上清的吸光度；根据所制得的标准曲线计算出纤维素酶酶活。本发明专利技术方法相对于传统的CMC钠盐测定方法，更能有效反馈出纤维素酶对不溶性底物的水解活性，即更能有效反馈出酶在各工业领域的应用潜力；本发明专利技术优化后的体系相对于国标法具有更低的检测限。

【技术实现步骤摘要】
一种测定工业用纤维素酶酶活力的方法
本专利技术涉及酶工程领域，具体涉及一种测定工业用纤维素酶酶活力的方法。
技术介绍
纤维素酶广泛应用与诸多领域，在纺织工业中，可以用来抛光及牛仔布洗色；在造纸工业中，可以用于纤维质前处理或打浆，还可以用于废纸回收的脱墨工艺；饲料工业中，可以用于饲料用酶的复配，提高动物对饲料的消化率等等。然而目前纤维素酶的酶活力评价主要以可溶性的羧甲基纤维素钠(简称CMC钠盐)为底物，但在纤维素酶的实际应用中，其底物往往比可溶性的CMC钠盐要复杂的多，通常是不溶性的纸张、纤维质、棉纤维等。所以通过CMC钠盐检测的纤维素酶活性很难真正反馈出酶对不溶性底物的活性，从而影响在实际工业应用中评估纤维素酶的应用潜力。国标滤纸酶活法只针对饲用纤维素酶(完整的酶系)，针对纺织、造纸等以内切葡聚糖酶为主的纤维素酶样品，评估能力有限，尤其是酶活较低的样品，很难完成评估。因此，探索并建立一种更为科学、客观和简便评估纤维素酶对不溶性底物酶活力的体外检测方法是迫切需要的。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种快速测定工业用纤维素酶酶活力的方法。与CMC法和国标滤纸酶活法对比，本法能更准确地评估工业纤维素酶的实际应用效果及潜力。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种测定工业用纤维素酶酶活的方法，包括下列步骤：1)试剂及材料准备；2)制作标准曲线；3)纤维素酶样品处理；4)设置实验组和对照组，分别加入纤维素酶底物和纤维素酶样品；5)进行酶解反应；6)以对照组为空白对照，测试5)中各组反应上清液的吸光度；7)根据2)所制得的标准曲线计算出纤维素酶酶活。进一步的，步骤3)中纤维素酶样品处理包括：纤维素酶样品用pH6.0-8.0磷酸缓冲液梯度稀释至合适浓度，以使吸光度保持在0.27-0.3之间即可。进一步的，步骤4)中纤维素酶底物为定量滤纸、棉布或其他纤维质材料；优选不溶性定量滤纸；更优选WHATMAN定量滤纸。进一步的，步骤5)中酶解反应为：水浴振荡摇床中反应酶解，反应时间控制在1h内(酶解时间可根据酶活调整延长或缩短)，优选30min，然后分别加DNS溶液终止反应。进一步的，步骤5)的酶解反应体系pH为6.0-8.0，反应温度50-70℃；优选pH6.0，反应温度50℃。进一步的，所述方法反应总体系为4mL；优选步骤4)加入1mL样品酶液、步骤5)加入3mLDNS终止液，不再做稀释处理，可以检测更低的酶活样品。进一步的，所述方法在工业用纤维素酶酶活评估的应用。本专利技术有益效果：本专利技术以不溶性的底物替代羧甲基纤维素钠，优选WHATMAN定量滤纸作为不溶性纤维素酶底物，相对国标法的Whatman1号定性滤纸而言，杂质干扰较小；以不溶性的定量滤纸替代羧甲基纤维素钠及定性滤纸作为为纤维素酶底物，更能反馈出工业用纤维素酶的实际应用环境。优化反应体系的温度、pH等使测定的结果更能科学地反馈纤维素酶对不溶性底物的亲和力及效价，从而更客观地反应出纤维素酶的应用效果及潜力；本专利技术优化后的反应体系中，酶解pH为6-8、反应温度50-70℃，更接近工业纤维素酶使用环境；优选4ml体系，即1mL酶液和3mLDNS终止液，不再做稀释处理，可以检测更低的酶活样品。本专利技术通过抛光实验实际应用试验来体现本专利技术方法评估纤维素酶酶活的潜力，相对于传统的CMC钠盐测定方法，更能有效反馈出纤维素酶对不溶性底物的水解活性，即更能有效反馈出酶在各工业领域的应用潜力；本专利技术优化后的体系相对于国标法具有更低的检测限。对比样品CMC活性、国标法滤纸活性及本法滤纸酶活，相同CMC酶活的不同样品，其滤纸活性差异较大，实际抛光应用试验说明滤纸酶活更能准确地反馈出纤维素酶的应用潜力及效价。附图说明图1：pH6.0葡萄糖标准曲线；其中纵坐标为光密度、横坐标为葡萄糖标准管的葡萄糖终含量。具体实施方式为了更好的说明本专利技术技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本专利技术技术方案包含但不限于以下实施方式。本专利技术实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。实施例1本专利技术方法纤测定维素酶酶活一、试剂及材料准备1)制备所需pH值的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液PH值与反应体系PH值一致)。2)定量滤纸准备：取WHATMAN定量滤纸于80℃烘干4h备用。3)葡萄糖标准溶液制备：称取1.000g无水葡萄糖(SIGMA)，溶于50.0mlpH6.0的磷酸缓冲液中，混匀定容至100ml，标明为一号标准液。取一号标准液10.0ml用pH6.0的磷酸缓冲液定容至100ml，标明为二号标准液。两种溶液4℃下密封可保存1个月。4)DNS试剂制备：溶解10.0g3,5--二硝基水杨酸，16.0gNaOH和300.0g酒石酸钾钠于700ml蒸馏水中，定容至1000ml，混匀后盛于棕色试剂瓶中,暗处放置一周后使用。二、标准曲线制作1)取6支试管按表1加入葡萄糖标准溶液，再在每管中加入3mlDNS试剂，充分混匀后置沸水浴中水浴5min,再经冷水冷却5min；2)以试管1作0对照，在540nm下测光密度，再以光密度为纵坐标，葡萄糖标准管的葡萄糖终含量为横坐标，绘出标准曲线(图1)。表1葡萄糖标准溶液配制表序号(试管号)123456缓冲液加入量(μl)10009008007507006502号标准液加入量(μl)0100200250300350葡萄糖终含量(μg)0100200250300350序号(试管号)123456三、本专利技术方法测定纤维素酶样品1的酶活1)纤维素酶样品处理：纤维素酶样品用pH6.0磷酸缓冲液梯度稀释至合适浓度(稀释了20倍)，以使吸光度保持在0.27-0.3之间即可；2)酶对照组：在试管中加入50mg的剪碎的定量滤纸，再加入1mL高温处理致失活的酶样品；3)酶实验组：在试管中加入50mg的剪碎的定量滤纸，再加入1mL50℃预热3min的酶样品；4)对照组与实验组反应体系PH为6.0，一同置于50℃的水浴振荡摇床中反应酶解30min，分别加3mL的DNS溶液终止反应；5)将上述对照组与实验组试管一同置于沸水浴中5min，然后冷水浴冷却5min；将试管内样品转移至离心管中，12000rpm高速离心，将滤纸屑沉淀，上清用于吸光度检测；6)以对照组为空白对照，测定实验组540nm下的吸光度为0.283，根据标准曲线读出实验组中酶解后产生的葡萄糖当量A(样品1对应葡萄糖当量A为115.72)；7)纤维素酶酶活计算：酶活性(U/mL)＝A×D/T×1.0，A为通过标准曲线读出的葡萄糖当量(μg)，D为样品的稀释倍数，T为酶解时间(min)，1.0为加入的待测酶液量(mL)。8)酶活定义：单位时间内，水解滤纸产生1μg还原糖定义为1个酶活单位，以μ/mL表示。计算本实施例中样品1的酶活约为77.14(U/mL)。实施例2本专利技术方法纤测定维素酶样品2的酶活一、试剂及材料准备(同实施例1)。二、标准曲线制作(同实施例1)。三、本专利技术方法纤测定维素酶酶活1)纤维素酶样品处理：纤维素酶样品用pH8.0磷酸缓冲液梯度稀释至合适浓度(稀释了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定工业用纤维素酶酶活的方法，其特征在于，包括下列步骤：2)制作标准曲线；3)纤维素酶样品处理；4)设置实验组和对照组，分别加入纤维素酶底物和纤维素酶样品；5)进行酶解反应；6)以对照组为空白对照，测试5)中反应上清液的吸光度；7)根据2)所制得的标准曲线计算出纤维素酶酶活。

【技术特征摘要】
1.一种测定工业用纤维素酶酶活的方法，其特征在于，包括下列步骤：2)制作标准曲线；3)纤维素酶样品处理；4)设置实验组和对照组，分别加入纤维素酶底物和纤维素酶样品；5)进行酶解反应；6)以对照组为空白对照，测试5)中反应上清液的吸光度；7)根据2)所制得的标准曲线计算出纤维素酶酶活。2.根据权利要求1所述的测定工业用纤维素酶酶活的方法，其特征在于，所述步骤3)中纤维素酶样品处理包括：纤维素酶样品用pH为6.0-8.0的磷酸缓冲液梯度稀释至合适浓度，使吸光度保持在0.27-0.3。3.根据权利要求1所述的测定工业用纤维素酶酶活的方法，其特征在于，所述步骤4)中纤维素酶底物为定量滤纸、棉布或其他纤维质材料。4.根据权利要求3所述的测定工业用纤维素酶酶活的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小明，崔金明，刘陈立，袁海，
申请(专利权)人：广州中国科学院先进技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44