一种米曲霉脂肪酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种米曲霉脂肪酶突变体及在拆分(R,S)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯制备(R)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第38位或第230位进行定点饱和单突变或多突变获得的。本发明专利技术通过比较突变体酶AOL‑3

【技术实现步骤摘要】
一种米曲霉脂肪酶突变体及其应用(一)
本专利技术涉及一种随机突变结合定点饱和突变获得的米曲霉脂肪酶突变体及其拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的应用，属于酶工程、基因工程
(二)
技术介绍
脂肪酶(EC3.1.1.3，triacylglycerollipase)即甘油三酯水解酶，可以作用在油水界面，能进行酯合化、酯水解、醇解、转酯等多种反应。脂肪酶广泛存在于自然界中，来源繁多，在植物、动物、微生物中均有发现。其中，产脂肪酶微生物的获得相对简单，适合进行大规模生产，有发酵周期短等优点，是工业用脂肪酶的重要来源和研究热点。产脂肪酶的微生物主要集中在根霉、曲霉、毛霉、青霉菌属等有工业应用前景的菌株。但是在传统的微生物研究中，自然界被开发利用的资源仅在1％左右，很多新型的脂肪酶还未被挖掘利用。随着研究的深入，发现很多脂肪酶具有结构选择的专一性，可以被用于手性化合物的合成和拆分，在油脂、农业、日用品、食品工业和药物合成等领域都能被应用。米曲霉主要存在于粮食、发酵食品、腐败有机物、土壤等处，还可用于生产各种酶制剂、有机酸、糖化饲料、益生素等，被美国食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)及世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)列为食品级安全菌株。米曲霉脂肪酶来源于米曲霉，最早在食品发酵过程中被发现，随后许多研究发现米曲霉脂肪酶在手性拆分、酯交换、酯合成方面有很大的作用。野生的米曲霉脂肪酶的产量低，催化活性、稳定性等不够理想，所以需要后期利用分子改造技术来提高。像丹麦NovoNordisk公司、日本Amano公司和美国Genencor公司等主要酶制造商也利用分子改造技术对微生物脂肪酶进行改造，提高酶活力、稳定性和立体选择性等酶学性质，以满足不同工业领域应用的需求。(R)-2-(4-羟基苯氧基)乙酯((R)-EHPP)是合成芳氧苯氧丙酸酯类除草剂(Aryloxyphenoxypropionate，简称APP)的关键手性中间体，APP类除草剂是一类能够有效防除禾本科杂草的除草剂，也是一类发展较迅速、不断开发出新品种的除草剂，迄今为止已有20个品种商品化，其中噁唑禾草灵、炔草酯、吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵是近几年来同类除草剂市场全球销售额最高的几个农药产品，由于手性APP类除草剂具有安全，高效和低毒等特性，近几年来该类除草剂越来越受到大家的关注。(三)
技术实现思路
本专利技术提供了一种米曲霉脂肪酶突变体，在最适的反应条件下，水解活性有明显的提高，在拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的应用中有更高的效率。本专利技术采用的技术方案：本专利技术提供一种米曲霉脂肪酶突变体，所述突变体是将SEQIDNO.1所示氨基酸序列第38位或第230位进行单点或多点饱和定点突变获得的(优选通过易错PCR结合定点饱和突变的方法来获得突变子)。所述SEQIDNO.1所示氨基酸序列(米曲霉脂肪酶)的编码基因序列为SEQIDNO.2所示。所述脂肪酶基因源自米曲霉(Aspergillusoryzae)WZ007，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCCNo:M206105，保藏日期：2006年10月8日，已在先前申请专利(中国专利CN101186938)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。本专利技术对目标脂肪酶基因进行分子改造，以提高酶的催化活性。进一步，所述米曲霉脂肪酶突变体为下列之一：(1)SEQIDNO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸分别突变为亮氨酸、组氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸；(2)SEQIDNO.1所示氨基酸第230位的颉氨酸突变为甘氨酸、异亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸；(3)SEQIDNO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第230位的颉氨酸分别突变为精氨酸或脯氨酸(优选精氨酸)；(4)SEQIDNO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第230位的颉氨酸分别突变为精氨酸或脯氨酸(优选精氨酸)。上述任一突变体基因同源性70％以上的核苷酸序列或其编码酶同源性80％以上的氨基酸序列均属于本专利技术要求保护的范围。本专利技术提供一种米曲霉脂肪酶突变体在拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯中的应用，所述的应用方法为：以含米曲霉脂肪酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎后的纯酶为催化剂，以(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯为底物，以pH7.5-8.0的Tris-HCl缓冲液(优选pH8.0，50mM)为反应介质构成反应体系，在30-40℃金属浴、800rpm条件下反应(优选30min)，反应结束后，转化液分离纯化，获得(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。所述反应体系中，纯酶用量以反应体系总体积计为50～250U/ml(优选200U/mL)，所述底物体积用量以反应体系总体积计为1～10％(优选1％)。进一步，所述催化剂制备方法为：将含有米曲霉脂肪酶突变体基因的工程菌接种到LB液体培养基中，37℃培养10h，将培养液以体积浓度1％的接种量转接到LB培养基，37℃培养至OD600为0.6时，加入终浓度0.1mM的IPTG，并将培养温度降到28℃，培养12h，收集湿菌体，超声破碎，离心，取上清进行镍离子亲和层析，得到米曲霉脂肪酶突变体纯酶。所述超声破碎条件为：功率100W、破2s，停6s，共破碎10min。所述镍离子亲和层析方法为：取上清上样至预平衡的镍柱中，分别用含终浓度300mMNaCl的50mMpH8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制成5mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑、500mM咪唑洗脱杂蛋白和目的蛋白，目的蛋白被250mM咪唑洗脱，收集250mM咪唑的流出液，经10KDa超滤膜浓缩20倍，浓缩液即为米曲霉脂肪酶突变体纯酶。所述含有米曲霉脂肪酶突变体基因工程菌构建方法为：将含有米曲霉脂肪酶突变体基因与载体pET28a(+)连接，转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，挑选转化子，获得工程菌。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术构建了米曲霉脂肪酶突变体，实现了米曲霉脂肪酶水解活性提高，对(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的拆分效率分别提高了75.5％和92.8％，通过比较突变体酶AOL-3F38N、AOL-3F38N-V230R和未突变酶AOL-3的水解能力，结果发现突变体酶AOL-3F38N、AOL-3F38N-V230R的水解活性是未突变脂肪酶的3.4倍和4.0倍，改造后的脂肪酶的热稳定性在50℃以后表现的更好，有利于后期的工业化应用。(四)附图说明图1脂肪酶突变体和原始脂肪酶基因AOL-3的比酶活比较。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本专利技术的保护范围内。LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种米曲霉脂肪酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第38位或230位进行单点突变或多点饱和定点突变获得的。

【技术特征摘要】
1.一种米曲霉脂肪酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQIDNO.1所示氨基酸序列第38位或230位进行单点突变或多点饱和定点突变获得的。2.如权利要求1所述米曲霉脂肪酶突变体，其特征在于所述米曲霉脂肪酶突变体为下列之一：(1)SEQIDNO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸分别突变为亮氨酸、组氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸；(2)SEQIDNO.1所示氨基酸第230位的颉氨酸突变为甘氨酸、异亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸；(3)SEQIDNO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第230位的颉氨酸分别突变为精氨酸、脯氨酸；(4)SEQIDNO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第230位的颉氨酸分别突变为精氨酸、脯氨酸。3.如权利要求2所述米曲霉脂肪酶突变体，其特征在于所述米曲霉脂肪酶突变体为下列之一：SEQIDNO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸分别突变为天冬酰胺；SEQIDNO.1所示氨基酸第38位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺同时第230位的颉氨酸突变为精氨酸。4.一种权利要求1所述米曲霉脂肪酶突变体在拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含米曲霉脂肪酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎后的纯酶为催化剂，以(R,S)-...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑建永，钟伟超，蓝星，章银军，汪钊，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33