一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法技术

本发明专利技术提供了一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法，涉及分析化学技术领域。本发明专利技术所述检测体系中包括B‑H2功能化纳米纤维膜，支撑DNA，输出DNA，竞争DNA，缓冲溶液，硫黄素T(ThT)，H1序列和凝血酶，将所述检测体系用于检测凝血酶时，基于纳米纤维膜表界面上反应热力学和动力学的提高，相应的检测体系具有1.0pM的检出限，且在50pM～5nM之间具有良好的线性关系，优异的选择性以及长期稳定性。本发明专利技术利用所述检测体系进行测样时，通过整合PiDSD过程，CHA放大以及ThT结合反应，避免了ELISA要求的分离和洗脱过程，节约时间，简化步骤。

【技术实现步骤摘要】
一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法。
技术介绍
蛋白标志物的灵敏、便捷、可靠及低成本的检测在现场检测(POCT)和早期诊断中的越来越重要。现在常见的检测方法如酶联免疫吸附测定法(ELISA)，电化学测定法，光学法等。这些方法包含多步分离和洗脱步骤，操作复杂，需要精密仪器，具有相对较低的灵敏度等特。静电纺丝纳米纤膜具有直径可控、多孔结构、高的比表面积以及易于修饰等优点，认为是一种理想的传感界面材料。基于静电纺丝纳米纤维膜的光化学传感器被报道用来检测蛋白标志物，如前列腺特异性抗原(PSA)，甲胎蛋白(AFP)，心肌肌钙蛋白I(cTnI)，C-反应蛋白(CRP)以及凝血酶。凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在代谢过程中，能够将可溶性纤维蛋白原转化为不可溶性纤维蛋白链。Xiang课题组报道了一种电化学适配体传感器，凝血酶的检出限低至5.6pM，该传感器结合了邻近结合诱导链置换反应和离子依赖DNAzyme循环信号放大反应(J.M.Yang,B.T.Dou,R.Yuan,Y.Xiang.Proximitybindingandmetalion-dependentDNAzymecyclicamplification-integratedaptasensorforlabel-freeandsensitiveelectrochemicaldetectionofthrombin.AnalyticalChemistry,2016,88,8218–8223)。Gu课题组报道了一种基于适配体功能化静电纺丝的三明治型凝血酶传感器，检测限为10pM，比96孔板的检出限低了2500倍(S.J.Lee,R.Tatavarty,M.B.Gu.Electrospunpolystyrene–poly(styrene-co-maleicanhydride)nanofiberasanewaptasensorplatform.Biosensors&Bioelectronics,2012,38,302–307)。Liu课题组报道了一种基于静电纺丝的荧光凝血酶传感器，检出限为42pM(H.M.Wang,W.Tang,H.J.Wei,Y.Zhao,S.C.Hu,Y.Guan,W.Pan,B.Xia,N.Li,F.Liu.Integratingdye-intercalatedDNAdendrimerswithelectrospunnanofibers:anewfluorescentsensingplatformfornucleicacids,proteins,andcells.JournalofMaterialsChemistryB,2015,3,3541–3547)。这些方法具有较高的灵敏度，但涉及多个反应和洗脱步骤，使得整个实验费时费力。Xing课题题组基于两种不同波长荧光基团标记的适配体探针和荧光相互关联光谱(FCCS)，使得凝血酶的检出限为0.8nM(X.M.Zhou,Y.H.Tang,D.Xing.One-stephomogeneousproteindetectionbasedonaptamerprobeandfluorescencecross-correlationspectroscopy.AnalyticalChemistry,2011,83,2906–2912)。这些一步法减少了实验步骤，节省了时间。然而，这些检测方法需要标记探针并制备纳米颗粒，灵敏度也较低。目前并没有一种操作简单、灵敏度高的一步法检测凝血酶的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法，操作简单，灵敏度高。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一步法荧光检测凝血酶的检测体系，包括B-H2功能化纳米纤维膜，支撑DNA，输出DNA，竞争DNA，缓冲溶液，ThT，H1序列和凝血酶；所述支撑DNA的序列如SEQIDNO.2～7所示，所述输出DNA的序列如SEQIDNO.8所示，所述竞争DNA的序列如SEQIDNO.9～14任一项所示，所述H1序列如SEQIDNO.15所示；所述缓冲溶液中包括以下浓度的成分：10～50mMTris，50～200mMNaCl，5～15mMMgCl2和10～30mMKCl，pH值为7.5。优选的，所述B-H2功能化纳米纤维膜的制备方法包括以下步骤：(1)将聚苯乙烯和四丁基溴化铵混合后溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，得PS/TBAB/DMF溶液；所述聚苯乙烯的质量为所述PS/TBAB/DMF溶液质量的15～25％；所述四丁基溴化铵在所述PS/TBAB/DMF溶液的质量体积比为0.1～0.5％。(2)将所述PS/TBAB/DMF溶液进行静电纺丝，烘干后得PS纳米纤维膜；所述静电纺丝时的电压为10～20kV，进样速度为2～8μL/min，接收距离为7～15cm，收集时间为1.5～3h；(3)利用介质阻挡放电产生的氩气等离子体处理所述PS纳米纤维膜，得处理后的PS纳米纤维膜；所述处理的电压为40～50V，电流为1.2～2.5A，放电处理时间为1～3min；(4)将所述处理后的PS纳米纤维膜浸泡于亲和素溶液中0.5～1.3h，取出后清洗，然后再与B-H2溶液反应0.6～1.5h，清洗后得B-H2功能化的纳米纤维膜；所述B-H2为经生物素标记的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的，步骤(1)所述四丁基溴化铵在所述PS/TBAB/DMF溶液的质量体积比为0.1～0.5％。优选的，步骤(1)所述溶解时伴随搅拌，所述搅拌的时间为20～28h。优选的，步骤(2)所述烘干的温度为75～85℃，烘干的时间为3.2～4.5h。优选的，步骤(2)得所述PS纳米纤维膜后，还包括对所述PS纳米纤维膜进行修剪。优选的，步骤(4)所述亲和素溶液的浓度为1.2～2.5μM。优选的，步骤(4)所述B-H2溶液的浓度为600～1000nM。本专利技术还提供了一步法荧光检测凝血酶的方法，包括以下步骤：将支撑DNA、输出DNA和缓冲溶液混合后于95℃温度下退火，得SO双链；将B-H2功能化纳米纤维膜、所述SO双链、竞争DNA、H1序列、ThT和待测样品混合后，在避光条件下反应后，测量膜的荧光。优选的，所述荧光的激发波长为450nm，收集470nm到700nm之间的发射光谱。本专利技术提供了一步法荧光检测凝血酶的检测体系，包括B-H2功能化纳米纤维膜，支撑DNA，输出DNA，竞争DNA，缓冲溶液，ThT，H1序列和凝血酶。本专利技术所述检测体系，整合了邻近诱导DNA链置换(PiDSD)、催化发夹自组装放大(CHA)和ThT结合反应三个过程。通过所述B-H2功能化纳米纤维膜的表界面行为，促进表界面上的动力学和热力学反应速率。在本专利技术实施例中，以凝血酶作为检测对象，检测限可达1.0pM，线性范围宽至50pM～5nM，并且具有特异性高、稳定性好的优势。附图说明图1为本专利技术所述凝血酶检测原理图；图2为本专利技术实施例中的PiDSD过程结果图和荧光变化图；图3为本专利技术实施例3中不同浓度凝血酶检测性能实验结果图；图4为本专利技术实施例4中检测体系检测特异性和稳定性结果图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一步法荧光检测体系，其特征在于，包括B‑H2功能化纳米纤维膜，支撑DNA，输出DNA，竞争DNA，缓冲溶液，ThT，H1序列和凝血酶；所述支撑DNA的序列如SEQ ID NO.2～7所示，所述输出DNA的序列如SEQ ID NO.8所示，所述竞争DNA的序列如SEQ ID NO.9～14任一项所示，所述H1序列如SEQ ID NO.15所示；所述缓冲溶液中包括以下浓度的成分：10～50mM Tris，50～200mM NaCl，5～15mM MgCl2和10～30mM KCl，pH值为7.5。

【技术特征摘要】
1.一步法荧光检测体系，其特征在于，包括B-H2功能化纳米纤维膜，支撑DNA，输出DNA，竞争DNA，缓冲溶液，ThT，H1序列和凝血酶；所述支撑DNA的序列如SEQIDNO.2～7所示，所述输出DNA的序列如SEQIDNO.8所示，所述竞争DNA的序列如SEQIDNO.9～14任一项所示，所述H1序列如SEQIDNO.15所示；所述缓冲溶液中包括以下浓度的成分：10～50mMTris，50～200mMNaCl，5～15mMMgCl2和10～30mMKCl，pH值为7.5。2.根据权利要求1所述检测体系，其特征在于，所述B-H2功能化纳米纤维膜的制备方法包括以下步骤：(1)将聚苯乙烯和四丁基溴化铵混合后溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，得PS/TBAB/DMF溶液；所述聚苯乙烯的质量为所述PS/TBAB/DMF溶液质量的15～25％；所述四丁基溴化铵在所述PS/TBAB/DMF溶液的质量体积比为0.1～0.5％；(2)将所述PS/TBAB/DMF溶液进行静电纺丝，烘干后得PS纳米纤维膜；所述静电纺丝时的电压为10～20kV，进样速度为2～8μL/min，接收距离为7～15cm，收集时间为1.5～3h；(3)利用介质阻挡放电产生的氩气等离子体处理所述PS纳米纤维膜，得处理后的PS纳米纤维膜；所述处理的电压为40～50V，电流为1.2～2.5A，放电处理时间为1～3min；(4)将所述处理后的PS纳米纤维膜浸泡于亲...

【专利技术属性】
技术研发人员：周翠松，李晓玲，肖丹，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51