一种重组刺参胶原多肽、制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种重组刺参胶原多肽，编码重组刺参胶原多肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其制备方法主要包括：S1、克隆基因；S2、构建载体质粒：将目的基因序列整合到载体质粒中，并将整合质粒导入至感受态基因工程菌中；S3、发酵及菌体收集：选取步骤S2中获得的阳性基因工程菌克隆，置于LB液体培养基中培养达到目标浓度，然后离心收集菌体；S4、纯化与透析：将步骤S3中收集到的菌体经过去除杂质后进行蛋白纯化，再进行蛋白透析。通过本方案中的制备方法可以高效制备刺参胶原多肽，解决了当前海参胶原多肽应用中遇到的海参培养、抓获及多肽提取成本高、杂质多、纯度低等问题；生产条件和步骤简单，反应条件易于控制、生产成本低以及纯度低的优点。

A Recombinant Collagen Polypeptide from Apostichopus japonicus, Its Preparation and Application

The present invention provides a recombinant sea cucumber collagen polypeptide. The nucleotide sequence encoding the recombinant sea cucumber collagen polypeptide is SEQ ID NO:2. The preparation method mainly includes: S1, cloning gene; S2, constructing vector plasmid: integrating the target gene sequence into the vector plasmid and introducing the integrated plasmid into the competent genetic engineering bacteria; S3, fermentation and bacterial collection: selecting 2 to obtain the recombinant sea cucumber collagen polypeptide. The clones of positive genetic engineering bacteria were cultured in LB liquid medium to reach the target concentration, and then centrifuged to collect bacteria; S4, purification and dialysis: After removing impurities, the bacteria collected in B were purified and then dialyzed. Through the preparation method in this scheme, the collagen polypeptide of sea cucumber can be efficiently prepared, and the problems encountered in the current application of sea cucumber collagen polypeptide, such as high cost of culture, capture and polypeptide extraction, high impurities and low purity, can be solved. The production conditions and steps are simple, the reaction conditions are easy to control, the production cost is low and the purity is low.

【技术实现步骤摘要】
一种重组刺参胶原多肽、制备方法及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种重组刺参胶原多肽、制备方法及其应用。
技术介绍
胶原蛋白广泛分布于多细胞动物的体内。一直以来，人们以为胶原只是作为一种支持组织蛋白而起作用。近年来，有关胶原的研究日渐增多，因其良好的生物学特性和弱的抗原性，经特殊处理后，可用于烧伤、创伤、美容、矫形、组织修复、创面止血等医药卫生领域，在这方面的研究已取得了可喜的成果。对海参(S.japonicus)胶原研究发现，刺参体壁含蛋白3.3％(湿重)，其中70％为胶原。氨基酸分析发现，胶原富含丙氨酸、羟脯氨酸，但羟赖氨酸含量较少，结果与先前研究中JohnA所提取的加州海参相似，类似于脊椎动物Ⅰ型胶原。但是海参是一种海洋生物，一方面培育或抓获海参，然后提取有效蛋白的程序繁琐，成本较大；另一方面抓捕海参容易造成生态环境的破坏，对海洋环境和生物链产生影响。因此需要研究利用基因工程菌来合成重组海参胶原多肽的相关技术，并研发所合成的重组海参胶原多肽的应用。
技术实现思路
：本专利技术目的是提供了一种重组刺参胶原多肽、制备方法及其应用，以解决现有技术中刺参培育、抓获及提取过程的低效等技术问题。为实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：一种重组刺参胶原多肽，编码所述重组刺参胶原多肽的核苷酸序列为SEQIDNO：2。一种重组刺参胶原多肽的质粒，包含权利要求1中所述的重组刺参胶原多肽的核苷酸序列。一种表达重组刺参胶原多肽的基因工程菌，包含权利要求2所述的质粒。一种权利要求1中所述重组刺参胶原多肽的制备方法，包括以下步骤：S1、克隆基因：获得人工合成的重组刺参胶原多肽的核苷酸序列；S2、构建载体质粒：用NdeI和XhoI限制性内切酶切割载体质粒，使重组刺参胶原多肽的核苷酸序列和载体质粒pET15b具有相同粘性末端，然后通过DNA连接酶将目的基因序列整合到载体质粒pET15b中，获得整合重组刺参胶原多肽的质粒，并将质粒导入至感受态基因工程菌中；S3、发酵及菌体收集：选取所述步骤S2中获得的阳性基因工程菌克隆，置于培养基中，然后收集菌体；S4、纯化与透析：将所述步骤S3中收集到的菌体经过去除杂质后，用FPLC系统进行纯化，然后再进行透析。优选的，所述步骤S3中进行小体系培养时，具体操作如下：用灭菌牙签挑取阳性克隆，置于含有5mLLB培养基(含100μg/mLAmpicillin)的培养管中，200rpm37℃培养过夜；优选的，所述步骤S3中进行大体系培养时，具体操作如下：将5mL小体系过夜培养的菌液转入1LLB(含100μg/mLAmpicillin)的培养基中，130rpm，37℃，培养2-4h；待培养液OD600值到达0.8后，加入1MIPTG133μL，继续培养20h后，8000rpm收集菌体。优选的，所述步骤S4中的蛋白纯化操作具体包括：将菌体用ResuspensionBuffer重悬，离心，弃上清；在菌体沉淀中加入5倍体积BufferB，反复吹打直至菌体溶液均一，离心，收集上清；用装有Ni-NTA柱的FPLC系统进行纯化，上柱后，用含有咪唑的ElutionBuffer进行洗脱并收集洗脱液。优选的，所述步骤S4中的蛋白透析操作具体包括：根据所述纯化操作中收集的洗脱液的体积，用蒸馏水稀释至10倍体积；将稀释后的洗脱液转移到500Da的半透膜中，用蒸馏水进行透析，每隔12小时换一次透析液，重复3-5次后获得多肽溶液。优选的，所述步骤S4之后还包括步骤S5、冷冻干燥：将透析后获得多肽溶液转移至25mL离心管中，放置冰盒上，转移至-80℃冰箱静置30min。优选的，还包括步骤S5检测：将纯化后的重组刺参胶原多肽制备成溶液，进行质谱检测。本专利技术还提供一种根据上述方法制备获得的重组刺参胶原多肽产品及其在护肤品领域的应用。一种刺参胶原多肽抗皱霜，包括以下重量份的各组分：A相：60-75份水；B相：3-6份植物角鲨烷，8-12份霍霍巴油，0.3-0.6份的茉莉精油，0.2-0.6份维生素E；C相：8-12份的透明质酸，0.8-1.2份的海藻糖，2-3份的烟酰胺，0.2-0.8份的海参胶原多肽；D相：0.5-1.2份乳化剂；其中所述胶原多肽为上述方法制备所得的重组刺参胶原多肽。本方案中的抗皱霜中各成分相互配合，功能互补。植物角鲨烷：保湿滋润，使毛孔舒张，有助其他成分吸收。霍霍巴油：具有良好稳定性，极易与皮肤融合，且具有超凡的抗氧化性，有滋养软化皮肤的功效。茉莉精油：改善皮肤干燥、缺水、过油及敏感状况，增加皮肤弹性。维生素E：抗氧化剂，对抗皮肤氧化老化。透明质酸：修复及保水作用。海藻糖：保持细胞活力，滋养皮肤。烟酰胺：抗氧化，抑制黑色素形成。海参胶原多肽：减少皮肤皱纹深度，抑制皮肤衰老过程，增加皮肤弹性。该配方的功效成分在保湿滋润的基础上，通过打开皮肤毛孔，促进抗衰老和抗氧化成分的吸收作用，增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。一种刺参胶原多肽抗皱霜的制备方法，包括以下步骤：(1)按照重量份比例称取A相，然后将C相的各组分按重量份比例称量好并依次溶于A相中，得混合液1；(2)按重量份比例称取B相中各组分，混合后得混合液2；(3)将所述步骤(2)中制得混合液2缓缓加入所述步骤(1)的混合液1中，轻轻搅拌，加入按重量份比例称量好的D相，然后置于均质乳化机1000rpm反应10min，得到抗皱霜成品。本专利技术的技术方案至少具有以下有益效果：1.通过本方案中的制备方法可以高效制备刺参胶原多肽，解决了当前海参胶原多肽应用中遇到的海参培养、抓获及多肽提取成本高、杂质多、纯度低等问题。2.本专利技术提供的基因工程菌生产重组刺参胶原多肽，具有产量高、生产条件和步骤简单，反应条件易于控制、生产成本低以及纯度低的优点，适用于大规模的生产。3.重组刺参胶原多肽具有很好的医用和美容价值，安全无害，应用领域广。附图说明图1为实施例1中构件的重组刺参胶原多肽的载体质粒示意图；图2为实施例1中质粒pET15b双酶切PCR的电泳照片；图3为实施例1中扩增PCR的电泳照片；图4为实施例1中重组刺参胶原多肽的质谱检测峰图；图5为实施例1中获得的重组刺参胶原多肽的固体粉末照片；图6为实验例1中重组刺参胶原多肽对成纤维细胞增殖作用的统计柱状图；图7为实验例2中重组刺参胶原多肽对成纤维细胞凋亡的作用的统计图；图8为实验例4中裸鼠使用实施例2中的抗皱霜前、后的皮肤褶皱变化对比照片；具体实施方式以下提供本专利技术的优选实施例，以助于进一步理解本专利技术。本领域技术人员应了解到,本专利技术实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本专利技术的方案。实施例1重组刺参胶原多肽的合成本实施例通过检索查询到刺参(拉丁名为Apostichopusjaponicas)的胶原多肽的氨基酸序列片段为SEQIDNO.1所示，具体为：FKALKQP，分子质量：831.03，基因登录号为APA22677。以下具体介绍利用基因工程菌合成重组刺参胶原多肽的操作步骤。S1、克隆基因：在上述刺参胶原多肽的氨基酸序列的N’端加上NdeI酶切位点，C’端加上XhoI酶切位点，然后根据大肠杆菌(Escherichiacoli)偏爱密码子表翻译后获得刺参胶原多肽的核苷酸序列，为SEQIDNO.2所示：5’—CATATGTTTAAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组刺参胶原多肽，其特征在于，编码所述重组刺参胶原多肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

【技术特征摘要】
1.一种重组刺参胶原多肽，其特征在于，编码所述重组刺参胶原多肽的核苷酸序列为SEQIDNO：2。2.一种重组刺参胶原多肽的质粒，其特征在于，所述质粒中包含权利要求1中所述的重组刺参胶原多肽的核苷酸序列。3.一种表达重组刺参胶原多肽的基因工程菌，其特征在于，包含权利要求2所述的质粒。4.一种权利要求1中所述重组刺参胶原多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、克隆基因：获得人工合成的重组刺参胶原多肽的核苷酸序列；S2、构建载体质粒：用限制性内切酶切割载体质粒，使重组刺参胶原多肽的核苷酸序列和载体质粒具有相同粘性末端，然后通过DNA连接酶将目的基因序列整合到载体质粒中，并将整合质粒导入至感受态基因工程菌中；S3、发酵及菌体收集：选取所述步骤S2中获得的阳性基因工程菌克隆，置于培养基中培养至菌体达目标浓度，然后收集菌体；S4、纯化与透析：将所述步骤S3中收集到的菌体去除杂质后，进行蛋白纯化操作，再进行蛋白透析操作。5.根据权利要求4所述的重组刺参胶原多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的蛋白纯化操作具体包括：将菌体用ResuspensionBuffer重悬，离心，弃上清；在菌体沉淀中加入5倍体积BufferB，反复吹打直至菌体溶液均一，离心，收集上清；用装有Ni-NTA柱的FPLC系统进行纯化，上柱后，用含有咪唑的ElutionBuffer进行洗脱并收集洗脱液。6.根据权利要求5所述的重组刺参胶原多肽的制备方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晨，陈枝辉，张楚晗，王玉珏，唐月婷，贺韶钦，张坤，洪晓林，贾力，王宗华，
申请(专利权)人：闽江学院，
类型：发明
国别省市：福建,35