一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法及应用，该方法为选取新鲜动物蹄筋肌腱，去除肌肉和油脂，分离获得白色的肌腱组织，剪碎获得小块肌腱组织，采用低温酸法溶解组织，获得胶原蛋白酸溶液；低温离心去除未降解的组织；胶原蛋白上清液经过冷冻干燥获得胶原蛋白粉末；该胶原蛋白粉末经过精确称量，重新溶解在酸溶液中，获得一定浓度的蛋白溶液。该胶原蛋白经过中和处理，可以形成胶原蛋白胨，胶原蛋白膜，以及与其他生物材料复合形成不同形式的功能材料。本发明专利技术的优点在于取材方便，价格低廉，制备过程简单、稳定，具有良好的生物相容性。可以应用于化妆品添加物、医用生物材料、组织工程、细胞培养等领域。

Extraction and application of collagen from tendon of hoof tendon in animals

The present invention provides a method for extracting collagen from tendon of hoof tendon of animals and its application. The method is to select fresh tendon of hoof tendon of animals, remove muscle and oil, isolate and obtain white tendon tissue, cut and obtain small tendon tissue, dissolve tissue by low temperature acid method, obtain collagen acid solution, remove undegraded tissue by low temperature centrifugation, and pass through collagen supernatant. Collagen powder was obtained by freeze-drying, which was weighed accurately and dissolved again in acid solution to obtain a certain concentration of protein solution. After neutralization, the collagen can form collagen peptone, collagen membrane and other biological materials to form different functional materials. The invention has the advantages of convenient sampling, low cost, simple and stable preparation process and good biocompatibility. It can be used in cosmetic additives, medical biomaterials, tissue engineering, cell culture and other fields.

【技术实现步骤摘要】
一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法及应用
本专利技术属生物
，具体涉及一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法及应用。
技术介绍
胶原蛋白主要存在于人和动物的多种组织器官中，在组织器官形状维持和正常生理功能中发挥重要作用。因其具有良好的生物相容性和可降解性，已经广泛应用于细胞培养、生物学、化妆品等领域。此外，胶原与其他材料结合制备的复合功能材料可以为损伤组织提供支架，也可以结合干细胞或者生长因子等，起到促进组织功能修复的作用。现有商品化的胶原蛋白来源主要包括，鼠尾胶原，动物皮，牛筋膜提取的胶原等。鼠尾胶原来源有限，动物皮胶原成分较复杂。牛筋膜组织较复杂，非基质胶原成分难以去除等缺陷。为了获得胶原成分相对单一，免疫源性较低的高纯度胶原蛋白，动物肌腱组织成为可选材料之一。肌腱组织致密，其中主要的细胞成分-成纤维细胞是胶原蛋白合成的主要来源，胶原成分主要为1型胶原。因此，动物肌腱组织来源充足，成分较单一，病原体感染较少，动物的基因和人比较接近，相容性较好等优势。因此，本专利技术以动物蹄为例，提取动物肌腱胶原蛋白成分，以期提供新的胶原蛋白材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白提取方法及应用。本专利技术一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法，具体包括如下步骤：(1)分离动物蹄筋肌腱：利用剪刀解剖分离动物蹄内白色肌腱，去除肌肉、脂肪和油脂和表面筋膜，无菌去离子水冲洗，获得白色肌腱。其中，肌肉、脂肪、油脂和表明筋膜等去除干净与否，决定了肌腱胶原蛋白的纯度，需要尽量去除干净。(2)将肌腱组织分解成微小组织：肌腱组织经过酒精消毒，无菌去离子水冲洗后，用锋利的剪刀将肌腱剪碎成微组织，加入充足的去离子水，用无菌的滤纸吸走表明油滴，清洗直至完全去除油脂。步骤(2)中，对所述肌腱组织消毒是，所述酒精浓度和作用时间为75％-80％酒精消毒3-5分钟，再用无菌水清洗5次以上。肌腱组织剪碎成(1～3)mm3的微组织。该步骤是为了减少污染，促进肌腱组织溶解。(3)低温酸处理肌腱组织：将肌腱微组织除水，加入一定浓度酸溶液，充分混匀，置于低温冰箱溶解数天，期间震荡促进溶解。步骤(3)中，低温酸处理肌腱组织所需酸溶液为弱酸溶液(如冰醋酸)，体积百分含量为0.2％-5％冰醋酸水溶液，低温范围在4-8°，肌腱微组织和所述体积百分含量为0.2％-5％冰醋酸水溶液的配比为2g:100ml，溶解时间为4-10天，每天震荡5次以上。该步骤是为了促进肌腱组织充分溶解。(4)提取胶原溶液：将溶液置于无菌离心管中，低温高速离心，收集上层液体，去除底部未溶解的组织。步骤(4)中，高速离心提取胶原溶液，采用离心速度(10000-12000)转/分钟，离心时间10-20分钟。该步骤是为了去除未溶解的胶原组织。(5)胶原粉末获得：将离心后的上清胶原溶液转移到无菌的器皿中，冷冻干燥获得胶原粉末；根据溶液量，调整冷冻干燥时间。该步骤是为了获得精确蛋白浓度的胶原蛋白溶液。(6)获得特定浓度的胶原蛋白溶液：冷冻干燥的胶原粉末再溶解需要体积百分含量为0.2％-2％冰醋酸水溶液，溶解时间为2-6天，可以获得浓度为(1-15)mg/ml胶原蛋白溶液，利用PH检测仪器，测定溶液PH值。该步骤是为了定量胶原蛋白溶液的蛋白浓度和酸浓度。一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法，该种方法同样适用于其他动物的蹄部肌腱和尾部肌腱组织。一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的应用，利用上述方法制备得到的动物蹄筋肌腱胶原蛋白材料，可应用于如下领域：(a)细胞培养过程中，对培养载体(培养皿/瓶，transwell，微流控芯片等)进行表面修饰，促进细胞粘附和生长；(b)细胞培养，二维和三维细胞等培养方式；(c)在心肌、神经、肌肉、血管、皮肤等组织工程应用中；(d)用于化妆品添加、面膜等护肤美容产品中；(e)制备用于医用生物材料、敷料、组织填充等产品；(f)干细胞培养和分化过程中；(g)与其他材料结合制备复合的功能材料；(h)食品添加剂。本专利技术胶原成分主要应用领域涉及到食品、化妆品、医学、科学研究等领域。本专利技术提供了一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法及应用，本专利技术的优点在于取材方便，价格低廉，制备过程简单、稳定，具有良好的生物相容性。可以应用于化妆品添加物、医用生物材料、组织工程、细胞培养等领域。附图说明图1：猪蹄肌腱分离后照片；图2：猪蹄肌腱溶解后照片；图3：胶原蛋白冻干照片；图4：胶原蛋白溶液照片图5：胶原蛋白粉的傅立叶红外谱图；；图6：胶原蛋白用于细胞培养图片；图7：胶原蛋白用于细胞三维培养图片；图8：胶原蛋白复合材料制备图片。具体实施例实施例1制备肌腱胶原蛋白溶液本实施例以猪蹄为例，从市场购得猪蹄，用清水刷洗干净，去除皮毛和肌肉。利用剪刀解剖分离猪蹄内白色肌腱，去除肌肉、脂肪和油脂和表面筋膜，无菌去离子水冲洗，获得白色肌腱(图1)。肌腱组织经过酒精消毒3-5分钟，无菌去离子水冲洗3次以上，用锋利的剪刀将肌腱剪碎成3-5毫米微组织(图2)，加入充足的去离子水冲洗3-5次冲洗，用无菌的滤纸吸走表明油滴，清洗直至完全去除油脂。配制体积百分含量为0.2％冰醋酸水溶液，过滤除菌4度备用。将剪碎的肌腱组织按照0.5％质量体积比加入到冰醋酸中，充分悬浮组织，置于4度冰箱溶解10天，每天震荡5次以上，促进肌腱组织溶解。将溶解的胶原溶液转移到50毫升离心管中，4度高速离心15分钟，转速在1.5万每分钟。收集上层溶液，去除底部未溶解的组织。将获得胶原溶液上清转移到10厘米无菌的培养皿中，冷冻干燥20-30小时，获得肌腱胶原粉末(图3)。无菌条件下定量，再溶解到体积百分含量为0.2％冰醋酸水溶液中，4度冰箱溶解6天，可以获得浓度为(1-15)mg/ml胶原蛋白溶液(图4)。图1为分离获得动物蹄肌腱，长约10厘米。图2为剪碎的肌腱组织置于无菌水中。图3为胶原溶液冷冻干燥后的胶原粉。图4为胶原粉再溶解到酸溶液中形成均匀白色乳浊液液。图5为胶原蛋白粉的傅立叶红外谱图。由图5可知，本专利技术所获得的肌腱胶原蛋白红外图谱与I型胶原主要出峰位置相似。3288cm1附近N-H伸缩振动，1627cm1附近是酰胺I带的C-O伸缩振动，1525cm1附近是酰胺II带的N-H弯曲振动，1444～1235cm1附近的吸收峰表明了胶原蛋白3股螺旋结构的完整性。由此可见，肌腱胶原蛋白主要成分为I型胶原。本实施例尝试了0.2％，0.4％，1％,2％,4％，5％体积比的乙酸溶液对肌腱组织的降解速度，结果显示乙酸浓度越高降解时间越短，获得是胶原蛋白越多。实施例2胶原蛋白的应用(1)胶原蛋白用于细胞培养：将胶原蛋白用0.2％冰醋酸稀释成(80-200)ug/ml的溶液，包被玻璃和塑料培养皿，4度过夜，37度固化4小时以上。或者60-70度烤箱烤干4小时以上。用无菌的PBS清洗，中和多余的酸溶液。加入人脐静脉内皮细胞和原代肾小球内皮细胞悬液，静置培养3天(图6)。图6为胶原蛋白包被玻璃培养皿后培养人脐静脉内皮细胞和大鼠原代肾小球内皮细胞。图6A为HE染色，图6B为CD31免疫荧光染色。细胞形态为典型的铺路石样。(2)细胞三维培养将10mg/ml胶原蛋白用PBS中和成6mg/ml溶液，加入肿瘤细胞U87,制备成悬液，加入到海藻酸钠丝内，进行三维培养(图7)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)分离动物蹄筋肌腱：利用剪刀解剖分离动物蹄内白色肌腱，去除肌肉、脂肪和油脂和表面筋膜，无菌去离子水冲洗，获得白色肌腱；(2)将肌腱组织分解成微小组织：肌腱组织经过酒精消毒，无菌去离子水冲洗后，用锋利的剪刀将肌腱剪碎成微组织，加入充足的去离子水，用无菌的滤纸吸走表明油滴，清洗直至完全去除油脂；(3)低温酸处理肌腱组织：将肌腱微组织除水，加入一定浓度酸溶液，充分混匀，置于低温冰箱溶解数天，期间震荡促进溶解；(4)提取胶原溶液：将溶液置于无菌离心管中，低温高速离心，收集上层液体，去除底部未溶解的组织；(5)冷冻干燥获得肌腱胶原蛋白粉末：将离心后的上层胶原溶液置于无菌培养皿中，低温冷冻干燥，获得肌腱胶原蛋白粉末；(6)定量胶原蛋白溶液浓度：无菌条件下，精确称量胶原蛋白粉末，再溶解于无菌的低温酸溶液中，低温溶解完全，获得一定浓度的胶原蛋白溶液。

【技术特征摘要】
1.一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)分离动物蹄筋肌腱：利用剪刀解剖分离动物蹄内白色肌腱，去除肌肉、脂肪和油脂和表面筋膜，无菌去离子水冲洗，获得白色肌腱；(2)将肌腱组织分解成微小组织：肌腱组织经过酒精消毒，无菌去离子水冲洗后，用锋利的剪刀将肌腱剪碎成微组织，加入充足的去离子水，用无菌的滤纸吸走表明油滴，清洗直至完全去除油脂；(3)低温酸处理肌腱组织：将肌腱微组织除水，加入一定浓度酸溶液，充分混匀，置于低温冰箱溶解数天，期间震荡促进溶解；(4)提取胶原溶液：将溶液置于无菌离心管中，低温高速离心，收集上层液体，去除底部未溶解的组织；(5)冷冻干燥获得肌腱胶原蛋白粉末：将离心后的上层胶原溶液置于无菌培养皿中，低温冷冻干燥，获得肌腱胶原蛋白粉末；(6)定量胶原蛋白溶液浓度：无菌条件下，精确称量胶原蛋白粉末，再溶解于无菌的低温酸溶液中，低温溶解完全，获得一定浓度的胶原蛋白溶液。2.按照权利要求1所述一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于：步骤(2)中，对所述酒精消毒，具体为采用75％-80％酒精消毒3-5分钟，所述无菌水清洗5次以上。3.按照权利要求1所述一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于：步骤(2)中，肌腱组织剪碎成1～3mm3的微组织。4.按照权利要求1所述一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述一定浓度酸溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，王丽，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21