棒状杆菌基因JNy31014在提高L-赖氨酸产量中的应用制造技术

本发明专利技术涉及棒状杆菌基因JNy31014在提高L‑赖氨酸产量中的应用。棒状杆菌基因JNy31014在提高棒状杆菌L‑赖氨酸产量中的应用，所述棒状杆菌基因JNy31014核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术首次公开了棒状杆菌基因JNy31014为棒状杆菌的细胞膜上的转运蛋白表达的控制基因，负责氨基酸类成分的转运，从而为基因改造谷氨酸棒状杆菌奠定了基础。

Application of Corynebacterium sp. JNy31014 Gene in Increasing L-Lysine Production

The present invention relates to the application of Corynebacterium gene JNy31014 in improving L lysine production. The application of Corynebacterium gene JNy31014 in improving L_lysine production of Corynebacterium is described. The nucleotide sequence of the Corynebacterium gene JNy31014 is shown in SEQ ID NO.1. The present invention discloses for the first time that Corynebacterium gene JNy31014 is a control gene for the expression of transporter protein on Corynebacterium cell membrane and is responsible for the transportation of amino acid components, thus laying a foundation for the genetic modification of Corynebacterium glutamicum.

【技术实现步骤摘要】
棒状杆菌基因JNy31014在提高L-赖氨酸产量中的应用
本专利技术涉及棒状杆菌基因JNy31014在提高L-赖氨酸产量中的应用，属于生物技术

技术介绍
赖氨酸是一种必需氨基酸，在维持人体氮平衡中起重要作用，是衡量食物营养价值的重要指标之一。食物中的蛋白质进入人体后经过消化先分解成氨基酸，人体在利用这些氨基酸合成新的人体蛋白质，在各种氨基酸中，赖氨酸是最重要的一种，没有它，其他氨基酸就受到限制或得不到利用，因此科学家称它为人体第一必须氨基酸。赖氨酸功能繁多：主要作用有促进人体发育、增强免疫功能；促进蛋白质、钙质的吸收和利用；提高儿童智力，促进身高和体重的增加；增加食欲，增强体质，改善营养不良；降低血中甘油三酯的水平，预防心血管疾病的发生；提高中枢神经组织功能等。目前主要在谷物、肉、大豆、奶、蛋等食物中获得。目前，可以通过不同的方法来生产L-赖氨酸，包括微生物发酵法(一步发酵法、两步发酵法)、酶法、蛋白水解法等。最常用的方法是微生物发酵法，是借助微生物具有生物合成自身所必需氨基酸的能力，利用微生物的代谢作用，通过对菌株进行改造，选育出各种氨基酸营养缺陷型和氨基酸结构类似物抗性突变株，从而解除生物合成途径中的反馈阻遏和抑制作用，达到过量积累代谢途径中L-赖氨酸的目的。用于生产L-赖氨酸的微生物包括多种属，如棒状杆菌(如谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum和钝齿棒杆菌Corynebacteriumcrenatum)、短杆菌(如黄色短杆菌Breibacteriumflavum和乳酸发酵短杆菌Brevibacteriumlactofermentus)、洛卡氏菌、念球菌、假单胞菌、埃希氏菌(如大肠杆菌Escherichiacoli)和芽孢杆菌(如浸麻芽孢杆菌Bacillusmacerans)、古生菌(如热变形菌Thermoprotensneutrophilus)以及真菌中的酵母菌(如隐球酵母Cryptococcusneoformans)等。目前，国内外用于工业化生产L-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、黄色短杆菌(B.flavum)、乳酸发酵短杆菌(B.lactofermentus)和大肠杆菌(E.coli)的改造型菌株。目前，国内外对L-赖氨酸生产菌种的选育主要通过诱变育种技术和代谢工程育种技术。代谢工程育种是从分子水平上通过最小限度的、最明确的基因改造来优化选育菌株。然而，与野生型菌株相比较，这些菌株存在很大的缺陷，如生长速度缓慢，糖耗速率低，对外界不良环境耐受力差等。随着生物技术的发展及谷氨酸棒杆菌基因组的解析，传统诱变育种获得L-赖氨酸高产菌方法逐渐被代谢工程育种方法所取代。同时大量研究表明，通过基因工程技术获得的基因工程菌，除保留了野生型菌株的一些优点外，还能很大程度上提高L-赖氨酸产量。如中国专利文献CN1539015A(申请号02815446.0)公开了包括accBC、accDA、catA、cysD、cysE在内的多个可用于赖氨酸产量提高的基因改进位点。中国专利文献CN101600796A(申请号200780048626.8)、CN1974760A(申请号200610163142.5)、CN103243042A(申请号201310092638.8)分别对基因NCg22534、NCgl1835、NCg21090进行失活获得一系列L-赖氨酸产率提高的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供棒状杆菌基因JNy31014在提高L-赖氨酸产量中的应用。本专利技术通过改造菌株谷氨酸棒状杆菌实现高产L-赖氨酸，具体策略为使棒状杆菌中的JNy31014基因失活，使代谢过程中L-赖氨酸合成的前体物质增多，从而提高L-赖氨酸产率，JNy31014基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术中，“失活”可以通过本领域已知的任何失活方法来诱导。“失活”产生的效果是指内源基因的表达被降低到很低的水平，或者产生不表达基因以及尽管被表达但表达不具有活性或活性降低的产物。在本专利技术中，“失活”可以通过基因工程手段在内源基因中插入一个或多个碱基对，或者缺失该内源基因中的一个或多个碱基对，或者由基因内部序列转换或颠换获得。本专利技术技术方案如下：棒状杆菌基因JNy31014在影响棒状杆菌胞内氨基酸向胞外转运过程中的应用，所述棒状杆菌基因JNy31014核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。棒状杆菌基因JNy31014在影响棒状杆菌胞内氨基酸产量中的应用，所述棒状杆菌基因JNy31014核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。棒状杆菌基因JNy31014在提高棒状杆菌L-赖氨酸产量中的应用，所述棒状杆菌基因JNy31014核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术优选的，所述应用，通过失活棒状杆菌中的基因JNy31014实现。根据本专利技术优选的，上述应用，所述棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌；进一步优选的，所述棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CICC23604。该菌株购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。一株高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌，所述谷氨酸棒状杆菌的棒状杆菌基因JNy31014失活，所述棒状杆菌基因JNy31014核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术优选的，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CICC23604。上述高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，步骤如下：(1)提取谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)23604基因组DNA，PCR扩增，制得棒状杆菌基因JNy31014的同源臂序列；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：F1:CGCGAATTCCACTTATCAGCCTCAACACTCCR1:AGGCCAGCAAAAGTTTCTTATGCAACGCCCACC；(2)制备抗性标签Cmr片段，然后将步骤(1)制得的同源臂序列与抗性标签Cmr片段链接，制得融合基因片段；(3)制备谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)23604感受态细胞；(4)将步骤(2)制得的融合基因片段转化步骤(3)制得的感受态细胞，经复苏、筛选，即得。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，Cmr片段来源于穿梭质粒pHT01。有益效果1、本专利技术首次公开了棒状杆菌基因JNy31014为棒状杆菌的细胞膜上的转运蛋白表达的控制基因，负责氨基酸类成分的转运，从而为基因改造谷氨酸棒状杆菌奠定了基础；2、专利技术人通过失活棒状杆菌基因JNy31014发现可以显著提高L-赖氨酸的产率，通过研究发现，改造后的菌株由于内源基因失活引起其他氨基酸的转运速率明显降低，与野生型相比，该菌株更有利于生产高浓度的L-赖氨酸，能够进一步降低以Corynebacteriumglutamicum菌株为生产菌株的生产成本。附图说明图1为本专利技术构建的JNy31014基因敲除片段示意图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步阐述，但本专利技术所保护范围不限于此。生物材料来源实施例中所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamic本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.棒状杆菌基因JNy31014在影响棒状杆菌胞内氨基酸向胞外转运过程中的应用，所述棒状杆菌基因JNy31014核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.棒状杆菌基因JNy31014在影响棒状杆菌胞内氨基酸向胞外转运过程中的应用，所述棒状杆菌基因JNy31014核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.棒状杆菌基因JNy31014在影响棒状杆菌胞内氨基酸产量中的应用，所述棒状杆菌基因JNy31014核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.棒状杆菌基因JNy31014在提高棒状杆菌L-赖氨酸产量中的应用，所述棒状杆菌基因JNy31014核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，通过失活棒状杆菌中的基因JNy31014实现。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌；进一步优选的，所述棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CICC23604。6.一株高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌，所述谷氨酸棒状杆菌的棒状杆菌基因JNy31014失活，所述棒状杆菌基因JNy31014核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。7.如权利要求6所述的高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriu...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪俊卿，薛乐，王瑞明，范翰，李丕武，修翔，张丽华，王松江，王建彬，郭传庄，隋松森，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，诸城东晓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37