表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因缺陷型重组干酪乳杆菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因缺陷型重组干酪乳杆菌及其构建方法和应用，所述的重组干酪乳杆菌是通过以胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因(thyA)为插入替换位点，插入牛乳铁蛋白肽的表达盒后得到。本发明专利技术构建获得的表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶缺陷型重组干酪乳杆菌没有抗生素选择标记，携带有组成型表达牛乳铁蛋白肽LFcinB和LFampin的基因表达盒，并且可利用胸腺嘧啶控制其生长，整合的外源基因能够随着细菌的复制而进行表达，并且具有一定的抑菌活性，是真正符合生物安全标准的食品级微生物。本发明专利技术的提出为具有益生菌和抗菌肽共有特性的表达牛乳铁蛋白肽的重组干酪乳杆菌菌株进一步应用于生产实践提供了物质基础。

Recombinant Lactobacillus casei with thymidine nucleotide synthase gene deficiency expressing bovine lactoferrin peptide and its construction method and Application

The invention discloses a thymidine nucleotide synthase gene defective recombinant Lactobacillus casei expressing bovine lactoferrin peptide and its construction method and application. The recombinant Lactobacillus casei is obtained by inserting the thymidine nucleotide synthase gene (thyA) into the expression box of bovine lactoferrin peptide as the insertion substitution site. The thymidine nucleotide synthase deficient recombinant Lactobacillus casei expressing bovine lactoferrin peptide constructed by the invention has no antibiotic selective marker, carries a gene expression box expressing bovine lactoferrin peptide LFcinB and LFampin, and can use thymidine to control its growth. The integrated exogenous gene can be expressed with the replication of bacteria, and has a certain degree of antibiotic selectivity. Its bacteriostatic activity is a food-grade microorganism that truly meets the biosafety standard. The invention provides a material basis for further application of recombinant Lactobacillus casei strain expressing bovine lactoferrin peptide with common characteristics of probiotics and antimicrobial peptides in production practice.

【技术实现步骤摘要】
表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因缺陷型重组干酪乳杆菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种重组干酪乳杆菌及其构建方法和应用，特别涉及一种能够表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因缺陷型重组干酪乳杆菌及其构建方法和应用。本专利技术属于生物

技术介绍
乳铁蛋白肽(Lactoferrcin,简写为Lfcin)是指在酸性条件下从乳铁蛋白中解离的一段多肽，具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、参与调节机体免疫等多种生物学功能。相继在猪、人、牛、小鼠、山羊等动物乳铁蛋白中检测出其同源物的存在。在各种乳铁蛋白肽中，牛乳铁蛋白肽抗菌活性最强，比牛乳铁蛋白提高400多倍，且对多种革兰氏阴性菌、真菌和革兰氏阳性菌均具有一定程度的抑制作用，因此这种广谱高效的抗菌肽显示了其作为饲料添加剂的潜在应用价值。LfcinB是由牛乳铁蛋白的第17-41位氨基酸组成的，氨基酸顺序为：Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala–Phe，含有3个赖氨酸、5个色氨酸和多个芳香族氨基酸残基，分子量是3100Da，具有强碱性，pI>815，其中的2个半胱氨酸结合成分子内二硫键使LfcinB分子呈不完全的桶状，LfcinB核磁共振光谱(NMR)的研究表明乳铁蛋白中的LfcinB是以α螺旋结构存在于低盐溶液中，而解离下来的LfcinB却是β折叠结构，结构转变后几乎所有的疏水性基团集中到了β折叠的一侧，另一侧则聚集了所有的亲水性基团，通过分子动力学运算可知LfcinB在水溶液中可迅速从α螺旋变为β折叠结构，这种构象变化使得LfcinB具有显著的双亲性且更易靠近细胞膜，从而解释了牛乳铁蛋白肽的抑菌活性明显高于乳铁蛋白的原因。与在溶液中不同的是，LfcinB晶体结构中两个色氨酸残基分于双亲分子的两侧，且第8位色氨酸面向溶液，第6位色氨酸面向肽的核心。2004年VanderKraan等在乳铁蛋白中发现了类似于Lfcin的抗菌活性区域，即为牛乳铁蛋白肽LFampin，它是由牛乳铁蛋白N端第268-284位氨基酸残基组成的，与人乳铁蛋白同源性为70％，在空间位置上与LfcinB靠近，且同样具有广谱抗菌活性。乳铁蛋白的抑菌机制使其对铁离子需求低的乳酸菌没有抑制作用，因此乳酸菌可用来选择作为其基因工程宿主菌。为了避免基因工程菌在使用过程中对环境造成的污染，本专利技术通过同源重组技术构建了表达牛乳铁蛋白肽的营养缺陷型的重组干酪乳杆菌，以期通过胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因的缺陷获得生长可控制的稳定表达牛乳铁蛋白肽的重组菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株能够表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因缺陷型重组干酪乳杆菌及其构建方法和应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术利用HCE组成型强启动子，T7g10增强子，肽聚糖水解酶信号肽和大肠杆菌rrnBT1T2串联强终止子为基本表达元件，以通过linker连接能够实现融合表达的两段牛乳铁蛋白肽(LFcinB和LFampin)为目的基因，构建基因表达盒LFEC；为验证表达盒，以XbaI和XhoI为酶切位点，重新扩增表达盒基因命名为XLFEC，与乳酸菌分泌型表达载体pPG-T7g10-PPαT连接，电转化干酪乳杆菌，获得重组菌pPG-XLFEC/L.caseiATCC393，Western-Blot检测显示获得约16.6KD的目的蛋白，表明表达盒构建成功，牛乳铁蛋白肽在干酪乳杆菌中获得表达。以胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因(thyA)为插入替换位点，以TF-Up和TF-Down为引物PCR扩增905bp的上游同源臂TF，以TR-Up和TR-Down为引物扩增1392bp的下游同源臂TR，利用SpeI和PacI酶切位点构建带有thyA上下游同源臂的重组质粒pMD19-TS-TFTR；以EcoRI和XhoI为酶切位点，重新扩增表达盒基因命名为ELFEC，并将其插入到构建好的重组质粒pMD19-TS-TFTR中，获得重组质粒pMD19-TS-TF-ELFEC-TR；再以乳酸菌温度敏感自杀型质粒pGBHCupp为载体，构建基因重组的打靶载体pGBHCupp-TF-ELFEC-TR，将该质粒电转化入干酪乳杆菌L.caseiATCC393后，通过升温至43℃使pGBHCupp-TF-ELFEC-TR质粒与L.caseiATCC393基因组的thyA基因两侧同源臂位点发生特定位点双交换重组，获得胸腺嘧啶核苷酸合成酶缺陷同时插入牛乳铁蛋白肽表达盒ELFEC的重组菌株ELFEC△thyAL.caseiATCC393。对重组菌株ELFEC△thyAL.caseiATCC393的遗传稳定性分析结果表明，重组乳酸菌经过连续50次传代培养，ELFEC表达盒保持稳定，且和原插入基因的同源性为100％；对重组菌株的胸腺嘧啶核苷酸合成酶缺陷性分析表明，重组菌在未添加胸腺嘧啶的GM17培养基中生长受到限制。对重组菌的抗生素抗性检测可见，重组菌株不具有基因打靶载体质粒的氯霉素抗性，表明重组菌无质粒残留，符合生物安全标准。WesternBlot检测牛乳铁蛋白肽在重组菌ELFEC△thyAL.caseiATCC393中的表达，结果显示，重组菌株在约16.6KD处出现一条特异的反应带，与预期结果相一致，表明获得了LFcinB和LFampin的融合表达；ELISA检测结果表明，重组菌蛋白OD490吸光值为0.1973，阳性对照组为0.1793，而阴性对照组为0.0657，P/N值＞2，表明表达的重组蛋白可与牛乳铁蛋白肽单克隆抗体发生特异性的反应；以间接免疫荧光实验检测重组蛋白表达，可见重组菌株ELFEC△thyAL.caseiATCC393细胞表面出现大量绿色荧光，而对照组则未出现绿色荧光，说明表达蛋白位于菌体细胞表面。为研究重组菌表达牛乳铁蛋白肽的抑菌活性，以时间动态曲线法测定超声后的重组菌上清对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和巴氏杆菌的抑菌作用，结果可见与L.caseiATCC393对照组相比，重组菌ELFEC△thyAL.caseiATCC393对测定的4种菌株均有明显的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用略强。在上述研究的基础上，本专利技术提出了一种表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因缺陷型重组干酪乳杆菌，所述的重组干酪乳杆菌是通过以胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因(thyA)为插入替换位点，插入牛乳铁蛋白肽的表达盒后得到，其中所述的牛乳铁蛋白肽的表达盒以HCE组成型强启动子、T7g10增强子、肽聚糖水解酶信号肽、Myc标签和大肠杆菌rrnBT1T2串联强终止子为基本表达元件，以通过linker连接的融合表达的两段牛乳铁蛋白肽LFcinB和LFampin为目的基因，构建得到牛乳铁蛋白肽基因表达盒，各元件的连接顺序为HCE组成型强启动子-T7g10增强子-肽聚糖水解酶信号肽-Myc标签-LFcinB-linker-LFampin-rrnBT1T2串联强终止子。其中，优选的，所述的牛乳铁蛋白肽的表达盒的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，本专利技术还提出了一种构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因缺陷型重组干酪乳杆菌，其特征在于，所述的重组干酪乳杆菌是通过以胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因(thyA)为插入替换位点，插入牛乳铁蛋白肽的表达盒后得到，其中所述的牛乳铁蛋白肽的表达盒以HCE组成型强启动子、T7g10增强子、肽聚糖水解酶信号肽、Myc标签和大肠杆菌rrnB T1 T2串联强终止子为基本表达元件，以通过linker连接的融合表达的两段牛乳铁蛋白肽LFcinB和LFampin为目的基因，构建得到牛乳铁蛋白肽基因表达盒，各元件的连接顺序为HCE组成型强启动子‑T7g10增强子‑肽聚糖水解酶信号肽‑Myc标签‑LFcinB‑linker‑LFampin‑rrnB T1 T2串联强终止子。

【技术特征摘要】
1.表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因缺陷型重组干酪乳杆菌，其特征在于，所述的重组干酪乳杆菌是通过以胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因(thyA)为插入替换位点，插入牛乳铁蛋白肽的表达盒后得到，其中所述的牛乳铁蛋白肽的表达盒以HCE组成型强启动子、T7g10增强子、肽聚糖水解酶信号肽、Myc标签和大肠杆菌rrnBT1T2串联强终止子为基本表达元件，以通过linker连接的融合表达的两段牛乳铁蛋白肽LFcinB和LFampin为目的基因，构建得到牛乳铁蛋白肽基因表达盒，各元件的连接顺序为HCE组成型强启动子-T7g10增强子-肽聚糖水解酶信号肽-Myc标签-LFcinB-linker-LFampin-rrnBT1T2串联强终止子。2.如权利要求1所述的表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因缺陷型重组干酪乳杆菌，其特征在于，所述的牛乳铁蛋白肽的表达盒的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种构建权利要求1或2所述的表达牛乳铁蛋白肽的胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因缺陷型重组干酪乳杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)含有表达盒LFEC的克隆载体的构建以HCE组成型强启动子、T7g10增强子、肽聚糖水解酶信号肽、Myc标签和大肠杆菌rrnBT1T2串联强终止子为基本表达元件，以通过linker连接的融合表达的两段牛乳铁蛋白肽LFcinB和LFampin为目的基因，构建得到牛乳铁蛋白肽基因表达盒，各元件的连接顺序为HCE组成型强启动子-T7g10增强子-肽聚糖水解酶信号肽-Myc标签-LFcinB-linker-LFampin-rrnBT1T2串联强终止子；将构建得到的表达盒命名为LFEC，并插入克隆载体pMD19-TSimple中，转化大肠杆菌感受态TG1中，筛选出阳性重组菌株后，将阳性重组菌命名为pMD19-TS-LFEC/TG1；(2)重组干酪乳杆菌表达载体pPG-XLFEC的构建将重组质粒pMD19-TS-LFEC中LFEC表达盒两端的酶切位点替换为XbaI和XhoI酶切位点，与含有同样酶切位点的乳酸菌分泌型表达载体pPG-T7g10-PPαT连接，连接后热转入大肠杆菌感受态TG1中，筛选出的阳性重组菌株命名为pPG-XLFEC/TG1；(3)含有pPG-XLFEC的干酪乳杆菌的制备将步骤(2)获得的阳性重组质粒pPG-XLFEC电转入干酪乳杆菌感受态细胞中，鉴定出阳性重组菌株，将其命名为pPG-XLFEC/L.caseiATCC393；(4)pMD19-TS-TF-ELFEC-TR/TG1的构建按照在GenBank中已发表的干酪乳杆菌W56株全基因序列，以thyA基因两侧的序列为基础，设计2对特异性引物，以L.caseiATCC393基因组为模版，扩增thyA基因的上游同源臂以及下游同源臂，分别回收扩增得到的上游同源臂以及下游同源臂，与克隆载体pMD19-TS连接后热转入大肠杆菌克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐丽杰，周晗，王丽，乔薪瑗，徐义刚，姜艳平，崔文，李一经，王宗莹，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23