一株多粘类芽孢杆菌菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株多粘类芽孢杆菌菌株及其应用，所述菌株为多粘类芽孢杆菌菌株YT9，保藏编号为CGMCC NO.15958。本发明专利技术分离出来的菌株，不仅对大豆疫霉菌具有强抑制作用，同时也对辣椒疫霉菌、烟草疫霉菌等植物病原卵菌和小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌、花生褐斑病菌等植物病原真菌均具有强拮抗作用，其中对大豆疫霉菌抑菌作用最强，高达86.27%±1.62%。此外，本发明专利技术的多粘类芽孢杆菌YT9菌株分离自健康大豆根际土壤，无生态毒性、安全性高、抑菌谱广、抑菌活性稳定持久且培养简单，在植物病害的生物防治中具有非常广泛的应用前景。

A Bacillus polymyxa strain and its application

The invention discloses a strain of Bacillus polymyxa and its application. The strain is Bacillus polymyxa strain YT9 and its preservation number is CGMCC NO. 15958. The strains separated by the invention not only have strong inhibitory effect on Phytophthora sojae, but also have strong antagonistic effect on plant pathogenic egg fungi such as Phytophthora capsici, Phytophthora tobacco and plant pathogenic fungi such as wheat sheath blight, wheat root rot fungi, peanut black spot fungi and peanut brown spot fungi spot fungi, among which the bacteriostatic effect on Phytophthora sojae is the strongest, up to 86.27%+1.62%. In addition, the strain YT9 of Bacillus polymyxa of the invention is isolated from the rhizosphere soil of healthy soybean, which has no ecological toxicity, high safety, broad bacteriostasis spectrum, stable and lasting bacteriostasis activity and simple culture, and has a very wide application prospect in biological control of plant diseases.

【技术实现步骤摘要】
一株多粘类芽孢杆菌菌株及其应用
本专利技术涉及微生物
，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌菌株及其应用。
技术介绍
大豆疫霉引起的大豆疫病是大豆生产上的毁灭性病害之一，每年造成全球大豆生产近20亿美元的经济损失。大豆疫病在大豆生长各个时期均可发生，表现为幼苗猝死和成株的根腐病，在潮湿多雨季节病害发生尤为严重，易造成大面积流行从而严重影响产量，限制大豆产业发展，造成重大经济损失。目前已报道的疫霉菌有100多种，其中绝大部分是危害农业和自然生态系统的植物病原菌(Kroonetal.,2012,ThegenusPhytophthoraanno2012.)，对多种农作物和经济作物造成不同程度的危害。由于疫霉菌隶属于茸鞭生物界卵菌门，与真菌遗传距离相距甚远，其大多数生化途径、侵染机制、结构特征都和真菌有着显著的差别，这导致许多传统杀真菌剂不能有效地用于疫霉病的防治，防治疫霉病属于重要难题之一。针对大豆疫病的防治方法多以选用抗病品种和化学防治为主。一方面，大豆抗病品种抗性会随着每年大豆疫霉菌群体结构发生巨大变化而逐渐丧失。另一方面，针对疫霉菌病害广泛使用的苯酰胺类化学杀菌剂如甲霜灵，作用靶标非常单一，极易使大豆疫霉菌产生抗药性。此外，化学农药的大量使用还破环了农业生态平衡，对人类的健康造成威胁。因此，发掘具有生防潜力的菌株、研发可代替化学杀菌剂的生物源杀菌剂对大豆疫病的防治有重大意义。生防菌的种类繁多，在生产上广泛应用的主要是一些真菌和细菌。生防细菌包括芽孢杆菌属、游动放线菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、链霉杆菌属、固氮杆菌属、根瘤杆菌属等多个属。芽孢杆菌类因其产生的芽孢具有良好的耐逆性，具有非常强的应用潜力和商业价值，是目前植物病害生物防治研究的重点方向。公开号为CN107151641A的专利公开了一株侧孢短芽孢杆菌SNB10无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌的盆栽试验防效为75.09%。公开号为CN103173386A的专利公开了一株多粘类芽孢杆菌G1对温室辣椒疫病防效为71.18%。公开号为CN108559716A的专利公开了一株多粘类芽孢杆菌WT3发酵液灌根对辣椒疫病的田间试验防效达85%。虽然目前已筛选出多粘类芽孢杆菌，表现出对多种病原菌的抑制作用，也有对疫霉菌引起的病害如辣椒疫病的防治作用，但是不同菌株对不同病原菌的抑制作用以及对其引起病害的防治存在巨大差异。由此，这些菌株不一定能适用于大豆疫霉菌引起的大豆疫病的生物防治。目前，适用于大豆疫病防治的多粘类芽孢杆菌生防菌株还十分缺乏。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）菌株YT9及其在抑制大豆疫霉菌中的应用，并提供一种该菌株制成的发酵液、液体菌剂及其制备方法。本专利技术提供的多粘类芽孢杆菌菌株YT9，分离自山东省烟台市大豆根际土壤中，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年6月19日，保藏编号为CGMCCNO.15958。本专利技术另提供一种多粘类芽孢杆菌菌株YT9的应用所述应用主要是在抑制大豆疫霉菌中的应用。该菌株是从健康大豆根际土壤分离出来的一株新型多粘类芽孢杆菌，经过试验验证该菌对大豆疫霉菌具有强抑制作用，同时也对辣椒疫霉菌、烟草疫霉菌等植物病原卵菌和小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌、花生褐斑病菌等植物病原真菌均有拮抗作用，无生态毒性，安全性高，抑菌谱广。本专利技术另提供一种前述多粘类芽孢杆菌菌株制成的发酵液及液体菌剂以及其制备方法。所述发酵液及液体菌剂的制备方法为：将活化后的多粘类芽孢杆菌菌株YT9在LB培养基中30℃，180rpm，振荡培养18-24小时后获得种子液，然后将种子液按照体积比1:100加入到发酵培养基中进行扩大培养，培养条件为30℃，180rpm，48小时；振荡培养48小时后的培养物即为发酵液，发酵液以10000rpm离心10min，收集菌体，以无菌水进行重新悬浮，获得液体菌剂。其中，所述发酵培养基具体为：酵母浸膏5g、蛋白胨5g、硝酸钠6g、氯化钠4g、蔗糖10-20g、玉米浆3-5mL、加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min制得。具体使用时，可以将发酵液一部分留用，一部分继续离心制得液体菌剂后再使用。按照上述制备方法制备得到的发酵液和液体菌剂活菌总浓度均为1.0×108cfu/mL-5.0×108cfu/mL。本专利技术的应用主要体现在防治大豆疫病中的应用。具体使用方法为：首先按照上述方法制得的液体菌剂以液体菌剂体积/种子质量为10mL/100g的比例处理浸泡后的大豆种子1小时，并在大豆幼苗期将浓度为含菌1.0×108cfu/mL-5.0×108cfu/mL发酵液稀释1000倍后灌根施用。本专利技术具有如下优点：本专利技术的多粘类芽孢杆菌YT9分离自健康大豆根际土壤，可以与土壤生态有效和谐相容，无生态毒性、安全性高、稳定性强。本专利技术以大豆疫霉菌为靶标，从生防细菌的筛选中寻找具有防治大豆疫病作用的生防细菌，为研发新型生物源杀菌剂提供新资源。最终专利技术人在试验中分离出一株对大豆疫霉菌有高效稳定抑制作用的菌株，也就是多粘类芽孢杆菌YT9。本专利技术的多粘类芽孢杆菌YT9培养简单、周期短、稳定性强，在植物病害生物防治中有非常广泛的开发应用前景。本专利技术提供了YT9菌株发酵培养优化方案，利用LB和牛肉膏蛋白胨培养基等常规细菌培养基进行发酵，YT9菌株生长量约为1.0×104cfu/mL-1.0×105cfu/mL，浓度低且不足以满足施用要求，本专利技术通过改良培养方案，添加蔗糖、玉米浆等使发酵后菌浓度显著提升。本专利技术分离出来的菌株，不仅对大豆疫霉菌具有强抑制作用，同时也对辣椒疫霉菌、烟草疫霉菌等植物病原卵菌和小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌、花生褐斑病菌等植物病原真菌均有拮抗作用，抑菌谱广。该菌株对大豆疫霉菌抑菌作用最强，抑菌率高达86.27%±1.62%，该抑菌率显著高于该菌株对同属于疫霉属的辣椒疫霉（抑菌率60.67%±3.06%）以及烟草疫霉（抑菌率74.67%±2.31%）的抑菌率，可见，该菌株对于大豆疫霉菌的抑菌作用具有十分突出的效果。并且专利技术人还通过试验得出不同的发酵液稀释倍数其防治效果不同，其中，菌浓度为1.0×108cfu/mL-5.0×108cfu/mL的发酵液1000倍稀释液防治效果高达81%，对大豆疫病温室防治效果十分显著。下面将通过具体实施例来对本专利技术进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整地传达给本领域的技术人员。附图说明图1：菌株YT9在LB平板上的菌落形态图；图2：菌株YT9与大豆疫霉菌对峙培养图；图中左侧为YT9与大豆疫霉菌对峙培养3天的情况，右侧为对峙培养30天的情况；图3：菌株YT9无菌滤液对大豆疫霉游动孢子萌发的抑制图；图中，A为对照组，游动孢子在发酵培养基处理条件下的萌发情况，B为处理组，游动孢子在YT9无菌滤液处理条件下的萌发情况；图4：菌种YT9蛋白酶活性图；图5：菌种YT9的纤维素酶活性图。具体实施方式如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株多粘类芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述菌株为多粘类芽孢杆菌菌株YT9，于2018年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15958。

【技术特征摘要】
1.一株多粘类芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述菌株为多粘类芽孢杆菌菌株YT9，于2018年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.15958。2.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌菌株在抑制大豆疫霉菌中的应用。3.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌菌株制成的发酵液及液体菌剂。4.一种权利要求3所述的发酵液及液体菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将活化后的多粘类芽孢杆菌菌株YT9在LB培养基中30℃，180rpm振荡培养18-24小时后获得种子液，然后按照种子液和发酵培养基以体积比为1:100的比例进行扩大培养，培养条件为30℃，180rpm；振荡培养48小时得到的培养物即为发酵液；将发酵液以10000rpm离心10min，收集菌体，以无菌水进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛玉婷，张娟，姚立强，王敏，武芳，姜春秀，郭玉欣，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37