本发明专利技术涉及一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备和应用。该纳米颗粒为：FA‑CS‑g‑OA负载DOX。制备方法包括：接枝叶酸的壳聚糖制备，接枝齐墩果酸的叶酸壳聚糖纳米颗粒制备，齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒制备。该方法操作简单、实验条件温和，载药量更大，且该壳聚糖载药纳米颗粒能够长效缓释药物。
Preparation and Application of Oleanolic Acid Grafted Chitosan Drug-loaded Nanoparticles
The invention relates to an oleanolic acid grafted chitosan drug-loaded nanoparticle, its preparation and application. The nanoparticles are FA CS g OA loaded with DOX. The preparation methods include: preparation of chitosan grafted with folic acid, preparation of folic acid chitosan nanoparticles grafted with oleanolic acid, and preparation of drug-loaded chitosan nanoparticles grafted with oleanolic acid. The method has the advantages of simple operation, mild experimental conditions, larger drug loading, and the chitosan-loaded nanoparticles can sustain the drug release for a long time.
【技术实现步骤摘要】
一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备和应用
本专利技术属于载药纳米材料及其制备方法和应用领域，特别涉及一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备方法和应用。
技术介绍
癌症仍然是世界上最主要的致命性疾病，而且未来癌症患者的预估数量是非常庞大的。根据2012年的调查，有超过1400万新的癌症病例出现，其中820万癌症患者最终死亡。虽然在过去的几十年里，癌症治疗取得了巨大的进展，但不幸的是，这种疾病治愈的病人数量仍然有限。尤其是乳腺癌，这种女性中最常见的癌症。据报道，只有23％的乳腺癌患者存活超过5年。化疗是治疗乳腺癌的主要手段。这种方法依靠化疗药物(如阿霉素、紫杉醇、吉西他滨、5-FU等)的高细胞毒性，广泛的杀死肿瘤细胞。然而，大多数常用的化疗药物都存在固有的缺陷，如对正常组织的毒副作用、水溶性差、生物利用度低、免疫原性差、血液清除快、耐药癌细胞的出现等。为了解决上述局限，研究人员越来越关注可以提高抗肿瘤药物的溶解度和靶向性的治疗药物，以及保护药物免受血液/肾清除和通过EPR效应快速实现药物在肿瘤位置的积累。另一方面，肿瘤细胞的多耐药性是癌症患者化疗失败的主要原因。其机制主要与膜转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)和多耐药蛋白(MRP1)的过表达有关，这些蛋白会泵出细胞内的抗癌药物，从而维持细胞中的低药物水平，这大大降低了细胞对药物的敏感性。研究结果表明，齐墩果酸(OA)可以增强许多抗癌药物的细胞毒性作用，这是由于其抑制了MRP1和P-gp活性，从而逆转了MRP1介导的抗癌药物外排，这称为“化学增敏效应”。除此之外，疏水性OA的引入可以为壳聚糖复合材料提供一个疏水核心，其在水中分散为两亲性纳米颗粒可通过自组装形成具有核壳结构的球体，并可装载疏水药物阿霉素(DOX)，在体内可发挥协同治疗乳腺癌的作用。因此，在这些抗肿瘤化疗药物的临床应用中，选择合适的药物载体是至关重要的。纳米药物传递系统的大小和细胞多耐药性的克服仍然是一项具有挑战性的任务。如何创新性地将抗肿瘤药物DOX和化疗增敏剂OA结合在一起，在肿瘤位置达到同步释放特性，值得深入研究。根据之前报道，MuhammadSarfraz等，利用脂质体载体构建将齐墩果酸和DOX共载药的纳米药物传递系统(MuhammadSarfraz，等.Oncotarget8(2017)47136-47153)，进行抗肿瘤治疗，得到了较好的治疗效果和较小的副作用。但该方法操作步骤较为复杂，载药量不够，主动靶向性偏低，其载体粒径也偏大。因此对这种共载药系统的深入探究，具有广阔的研究前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备方法和应用，以克服现有技术中肿瘤细胞多耐药性的缺陷。本专利技术的一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒，所述纳米颗粒为：FA-CS-g-OA负载DOX，其中FA-CS-g-OA的结构式为：式中n＝50～100。本专利技术的一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒的制备方法，包括：(1)将叶酸FA经EDC和NHS活化，将活化后的FA加到溶有壳聚糖的醋酸缓冲液中，避光搅拌，透析，除去未反应的FA，冻干，得到接枝叶酸的壳聚糖FA-CS，其中FA、EDC和NHS的摩尔比(确认)为1:1～1.5:1～1.5，叶酸FA与壳聚糖的摩尔比为500:1～100:1；(2)在DMAP的存在下，将步骤(1)中FA-CS溶解在吡啶中，加入齐墩果酸OA，搅拌反应，纯化，得到接枝齐墩果酸的叶酸壳聚糖纳米颗粒FA-CS-g-OA，冻干，其中FA-CS、DMAP、吡啶和OA的摩尔比为1:0.00001～1:0.01～1:400～0.0001；(3)将步骤(2)中冻干后的FA-CS-g-OA溶于水中，将DOX溶解于有机溶剂中，将得到的FA-CS-g-OA溶液和DOX溶液一起密封在透析袋中透析，离心去除未载上的药物，得到自组装成的齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒FA-CS-g-OA@DOX，其中FA-CS-g-OA溶液浓度为8～15mg/mL，DOX溶液浓度为1～3mg/mL，FA-CS-g-OA与DOX的摩尔比为4:1～6:1。所述步骤(1)中将叶酸FA经EDC和NHS活化具体为：将叶酸FA、EDC和NHS加入到无水DMSO溶液中，在室温下搅拌0.5～2h。所述步骤(1)中醋酸缓冲液浓度为0.8～1.5％w/v。所述步骤(1)中溶有壳聚糖的醋酸缓冲液pH值为4～5。所述步骤(1)中避光搅拌为：室温下避光搅拌过夜。所述步骤(1)中透析为：用MWCO＝3000～5000的透析袋在1.0mMNaOH溶液中透析70～80小时。所述步骤(2)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为2～5h。所述步骤(2)中纯化具体为：旋转蒸发掉溶剂，得到的沉淀物溶解在丙酮中，用水冲洗三次。所述步骤(3)中透析袋是用Mw＝8000～10000Da的透析袋。所述步骤(3)中透析温度为20～30℃，透析时间为40～50h。所述步骤(3)中有机溶剂为DMSO。所述步骤(3)中离心为：5000～8000rpm离心20～40分钟。本专利技术的一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒的应用。将本专利技术的FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒溶于PBS缓冲液中，置于透析袋。于三种不同pH值环境下测定其药物释放，于不同时间点取样，并补充缓冲液，得出药物释放曲线。药物释放所需的FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒为1mg，外缓冲液每次取液并补充的体积为1ml。将本专利技术的FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒分别应用于正常细胞和乳腺癌细胞检测细胞存活情况，验证其体外抗癌效果。检测细胞存活实验中FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒的上样量为每孔加入20μl溶有DOX的PBS溶液(DOX浓度从0.001到10μg/ml)。本专利技术利用壳聚糖纳米载药颗粒FA-CS-g-OA@DOX中齐墩果酸(OA)的疏水性，纳米颗粒自组装形成的疏水中心可负载大量疏水药物，合成含DOX的乳腺癌靶向的壳聚糖接枝聚合物载药复合材料。有益效果(1)本专利技术方法操作简单、实验条件温和；(2)制备得到的载药纳米颗粒粒径160nm左右，能够通过EPR效应最大程度的在乳腺癌位置聚集；(3)本专利技术的含DOX的乳腺癌靶向壳聚糖载药复合材料能够长效缓释药物。且具有pH响应性药物释放，在肿瘤位置较低的pH值环境下加速释放DOX和OA，减少损害其他正常组织，具有继续往后相关实验分析的潜力；(4)本专利技术的乳腺癌靶向壳聚糖纳米载药颗粒FA-CS-g-OA@DOX释放的OA，可以减少肿瘤细胞P-gp和MPR1的表达，从而抑制肿瘤的耐药性，达到协同治疗的效果，增强抗癌作用。附图说明图1为本专利技术制备乳腺癌靶向的壳聚糖接枝纳米复合物FA-CS-g-OA的工艺过程。图2为实施例1中FA-CS-g-OA纳米颗粒的1HNMR图谱。图3为实施例1中FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒的TEM图。图4为实施例2中载有DOX的FA-CS-g-OA@DOX载药纳米颗粒在不同pH环境下DOX(A)和OA(B)的释放曲线。图5为实施例3中药物DOX、单纯的OA、载体FA-CS-g-OA及载药纳米颗粒FA-CS-g-OA@DOX对乳腺癌(A)和正常细胞(B)的MTT结果。图本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒为：FA‑CS‑g‑OA负载DOX，其中FA‑CS‑g‑OA的结构式为：
【技术特征摘要】
2018.11.15 CN 20181135921231.一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒为：FA-CS-g-OA负载DOX，其中FA-CS-g-OA的结构式为：式中n＝50～100。2.一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒的制备方法，包括：(1)将叶酸FA经EDC和NHS活化，将活化后的FA加到溶有壳聚糖的醋酸缓冲液中，避光搅拌，透析，冻干，得到接枝叶酸的壳聚糖FA-CS，其中FA、EDC和NHS的摩尔比为1:1～1.5:1～1.5，叶酸FA与壳聚糖的摩尔比为500:1～100:1；(2)在DMAP的存在下，将步骤(1)中FA-CS溶解在吡啶中，加入齐墩果酸OA，搅拌反应，纯化，得到接枝齐墩果酸的叶酸壳聚糖纳米颗粒FA-CS-g-OA，冻干，其中FA-CS、DMAP、吡啶和OA的摩尔比为1:0.00001～1:0.01～1:400～0.0001；(3)将步骤(2)中冻干后的FA-CS-g-OA溶于水中，将DOX溶解于有机溶剂中，将得到的FA-CS-g-OA溶液和DOX溶液一起密封在透析袋中透析，离心，得到齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒FA-CS-g-OA@DOX，其中FA-CS-g-OA溶液浓度为8～15mg/mL，DOX溶液浓度为1～...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱利民，牛世伟，吴建荣，张雪静，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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