一种基于线粒体基因nad2检测猪华支睾吸虫的PCR试剂盒及应用制造技术

一种基于线粒体基因nad2检测猪华支睾吸虫的PCR试剂盒，包含无菌去离子水、PCR反应液、Taq DNA polymerase、GoldView DNA染料、6×Loading Buffer、标准品、对照品。本发明专利技术试剂盒是一个反应即可快速、准确地检测出被检样本中的猪华支睾吸虫DNA，也可用于猪华支睾吸虫虫感染的分子流行病学调查及疗效监测。本发明专利技术的模板DNA制备步骤简单费用低，尤其是用于大量样品的大规模检测时，操作简单，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。本发明专利技术试剂盒可在检测猪华支睾吸虫中的应用。本发明专利技术试剂盒的应用是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强的检测方法。

PCR kit for detection of Clonorchis sinensis based on mitochondrial gene nad2 and its application

A PCR kit for detection of Clonorchis sinensis based on mitochondrial gene nad2 was developed, including sterile deionized water, PCR reaction solution, Taq DNA polymerase, GoldView DNA dye, 6 Loading Buffer, standard reference substance and reference substance. The kit is a * * reaction which can detect the clonorchis sinensis DNA in the samples quickly and accurately, and can also be used for molecular epidemiology investigation and monitoring of the treatment of swine Clonorchis sinensis infection. The template DNA preparation step of the invention is simple and low in cost, especially when used for large-scale detection of a large number of samples, the operation is simple, not only saves time and labor, but also saves a large number of reagents and consumables, and improves the work efficiency. The kit can be applied to detect Clonorchis sinensis. The application of the kit is a sensitive and specific detection method based on molecular biology.

【技术实现步骤摘要】
一种基于线粒体基因nad2检测猪华支睾吸虫的PCR试剂盒及应用
本专利技术涉及生物技术，涉及一种基于线粒体基因nad2检测猪华支睾吸虫的PCR试剂盒，可以对感染猪华支睾吸虫的样本进行鉴别检测。
技术介绍
目前我国人群流动性越来越大，生食海鲜、喜好野味的人也越来越多，各种动物源性疾病开始在非流行区播散，食源性寄生虫病已对公共卫生构成巨大的威胁。华支睾吸虫病是由华支睾吸虫(Clonorchissinensis)寄生于人和动物肝脏胆管和胆囊内引起的一种人畜共患寄生虫病。华支睾吸虫终末宿主是人和多种哺乳动物，中间宿主有两个，第一中间宿主是淡水螺，第二中间宿主为多种淡水鱼类和淡水虾。华支睾吸虫病在我国流行极为广泛，患者或患畜因虫体对胆管的机械性损伤和阻塞及虫体分泌排泄物刺激作用而引起胆管及其周围炎症，导致肝实质萎缩、硬化、功能障碍及全身性症状。而且因胆管阻塞及炎症引起的上皮增生等会导致胆管变窄，胆汁流出不畅，引起阻塞性黄疸，容易合并细菌感染引发化脓性胆管炎，肝脓肿。虫卵还可以引起结石，胆管上皮细胞增生可致癌变。调查表明，我国约为3200多万感染者，感染率居前三位的依次是广东(16.42％)、广西(9.75％)、黑龙江(4.72％)，其次是台湾、香港、吉林和辽宁。华支睾吸虫的感染不仅给人类健康造成威胁，而且也给养殖业造成巨大经济损失，严重危害养殖业的健康发展。对华南地区淡水螺和淡水鱼虾调查显示，淡水螺感染率为0.25％、淡水鱼16.94％、淡水虾5.83％。面对严峻的形势，急需简便快捷的快速诊断方法，可以对患者尽早确诊，对检出的阳性患畜或者水产品也可以尽早采取切实有效的治疗措施，降低损失。目前较常使用改良加藤厚涂片法(一粪三检)镜检虫卵，SPA协同凝集实验与ELISA等免疫学方法。镜检法费时费力，效益较低，敏感性低。SPA方法操作过程繁琐，ELISA非常敏感，但假阴性率较高。上述三种方法都不能实现现场检测，不易于推广应用。因此，对华支睾吸虫病建立一种操作简单、快速、敏感、特异的检测方法迫在眉睫。PCR方法是一种操作简单、敏感性高、特异性强的分子生物学检测方法，可以为临床上华支睾吸虫的防治提供科学依据，而且对提高动物疫病的检测、监控水平，保障动物源性食品安全具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于线粒体基因nad2检测猪华支睾吸虫的PCR试剂盒，该试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应液、TaqDNApolymerase、GoldViewDNA染料、6×LoadingBuffer、标准品、对照品。其中，PCR反应液含有10×PCRBuffer、dNTPs、检测用引物、ddH2O。所述检测用引物为华支睾吸虫线粒体基因nad2上游引物和下游引物共2条：标准品序列为猪华支睾吸虫(C.sinensis)，其核苷酸序列如SEQIDNo:3所示，具体序列见序列表。对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有猪华支睾吸虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无华支睾吸虫DNA的DNA样品。本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。本专利技术的另一个目的是提供所述试剂盒在检测猪华支睾吸虫中应用。通过以下步骤实现：每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为27ng/μl。(1)PCR反应管制备：总体积为25μl，PCR反应液于冰上融化及制备PCR反应管。依次取PCR反应液21.75μl，TaqDNA聚合酶0.25μl，浓度27ng/μl的样品DNA(分别为待检测样本、标准品、阳性对照品、阴性对照品的DNA，分别加在反应管内)3μl于PCR反应管中混合。用手指轻弹制备好的PCR反应管或用微量移液器吹打混匀，瞬时高速离心5s。(2)扩增检测：把PCR反应管置于PCR仪上，设置反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸60s共30个循环，72℃总延伸10min，4℃保存。(3)检测结果判定：将1g琼脂糖溶于100ml的0.5×TBE电泳缓冲液中，然后加入5μlGoldViewDNA染料，混匀后煮沸，倾倒凝胶板。凝胶冷却凝固后，将PCR产物6μl与适量上样缓冲液混合，加入凝胶孔中进行电泳。电泳结束后取出凝胶置于紫外灯下观察、拍照。标准品孔和阳性对照孔均有目的条带而阴性对照孔无任何条带说明PCR反应检测成功。被检样本孔出现的电泳条带与标准品孔、阳性对照孔相应条带大小一致则判定为阳性，反之则为阴性。本专利技术提供了一种猪华支睾吸虫的PCR检测试剂盒，是一个即可快速、准确地检测出被检样本中的猪华支睾吸虫DNA的试剂盒，也可用于猪华支睾吸虫虫感染的分子流行病学调查及疗效监测。本专利技术的模板DNA制备步骤简单费用低，尤其是用于大量样品的大规模检测时，操作简单，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。本方法是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强的检测方法。附图说明图1华支睾吸虫标准品的PCR产物电泳结果。图2华支睾吸虫阳性样本的PCR检测结果。图3本专利技术对采集的部分样本检测结果。具体实施方式本专利技术结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术范围。实施例一华支睾吸虫标准品的PCR检测1.材料TaqDNA聚合酶反应系统、pMD18-T克隆系统、通用基因组提取试剂盒(UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0)、250bpDNA分子量标准marker均购自宝生物工程(大连)有限公司，质粒小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒为杭州艾思进有限公司产品，氨苄青霉素等常用试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，PCR仪为德国T-gradientPCR仪。2.引物设计与合成以上述目的基因序列为模板，使用PrimerPremier5.0软件进行分析、设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。3.检测标准品制备取猪华支睾吸虫的虫体，根据通用基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA作为模板，用虫体的标准品上下游引物在PCR仪上进行扩增，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸60s共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖电泳确认条带大小正确之后切下目的条带进行凝胶回收。回收产物用克隆系统插入pMD18-T载体，并转化入大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基中培养，将阳性克隆送杭州华大基因研发中心进行测序验证。测序表明插入片段正确的相应凝胶回收产物用无菌去离子水调整为27ng/μl即为标准品。4.结果经测序表明，上述设计标准品完全与预期符合，猪华支睾吸虫标准品目的基因序列如序列表的SEQIDNo:3。PCR结果见图1：M，250bpDNAmarker；1：猪华支睾吸虫标准品参考条带；2：阴性对照品。实施例二猪华支睾吸虫阳性样本的PCR检测1.样本DNA提取分别采集1例经传统方法确诊的猪华支睾吸虫病猪猪粪样本9克及5例无猪华支睾吸虫健康猪猪粪样本各9克，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为27ng/μl。2.样本检测取出PCR反应液于冰浴融化后取21.75μl，加入DNA聚合酶0.25μl，再加入待检样本DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于线粒体基因nad2检测猪华支睾吸虫的PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应液、Taq DNA polymerase、GoldView DNA染料、6×Loading Buffer、标准品、对照品，其中，PCR反应液含有10×PCR Buffer、dNTPs、检测用引物、ddH2O，所述检测用引物为华支睾吸虫线粒体基因nad2上游引物和下游引物共2条：华支睾上游引物：5'‑TTCTTGAGTTGGCTTCCT‑3'华支睾下游引物：5'‑CCTCAGCAACATAACCAC‑3'标准品序列为猪华支睾吸虫(C.sinensis)，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于线粒体基因nad2检测猪华支睾吸虫的PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应液、TaqDNApolymerase、GoldViewDNA染料、6×LoadingBuffer、标准品、对照品，其中，PCR反应液含有10×PCRBuffer、dNTPs、检测用引物、ddH2O，所述检测用引物为华支睾吸虫线粒体基因nad2上游引物和下游引物共2条：华支睾上游引物：5'-TTCTTGAGTTGGCTTCCT-3'华支睾下游引物：5'-CCTCAGCAACATAACCAC-3'标准品序列为猪华支睾吸虫(C.sinensis)，其核苷酸序列如SEQIDNo：3所示。2.根据权利要求1所述的一种基于线粒体基因nad2检测猪华支睾吸虫的PCR试剂盒，其特征在于，对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有猪华支睾吸虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无华支睾吸虫DNA的DNA样品。3.权利要求1所述的试剂盒在检测猪华支睾吸虫中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下技术方案实现：(1)被检样本DNA提取：被检样本DNA提取采用大连宝生物工程有限公司的试剂盒，按照说明书中粪便DNA的提取方法进行操作；(2)设置PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨怡，杜爱芳，郭筱璐，潘辰，孙洪超，陈学秋，阳毅敏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33