枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的制备方法，该制备方法按以下步骤顺序进行：制备枣粗提物、醇沉、大孔树脂层析柱分离、膜分离、制备液相色谱分离。该方法以醇为提取液，采用大孔吸附树脂分离、膜分离、制备液相色谱分离三种分离手段，获得的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷纯度高，环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的纯度分别达90%以上。应用制备液相色谱还可以实现在线监测，针对性分离，分离效率高。

Extraction Method of Cyclic Adenosine Phosphate and Cyclic Guanosine Phosphate from Jujube Fruit

The invention discloses a preparation method of cyclic adenosine phosphate and guanosine cyclic phosphate in jujube fruit. The preparation method is carried out in the following steps: preparing crude jujube extract, alcohol precipitation, macroporous resin chromatography column separation, membrane separation and preparative liquid chromatography separation. The purity of adenosine cyclophosphate and guanosine cyclophosphate was high, and the purity of adenosine cyclophosphate and guanosine cyclophosphate were over 90% respectively. The application of preparative liquid chromatography can also realize on-line monitoring, targeted separation and high separation efficiency.

【技术实现步骤摘要】
枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的提取方法
本专利技术属于天然产物提取
，涉及枣果中天然成分的提取，具体地说是枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的制备方法。
技术介绍
环磷酸鸟苷与环磷酸腺苷都是一种具有细胞内信息传递作用的第二信使。环磷酸腺苷是由三磷酸腺苷在腺苷环化酶催化下生成，能调节细胞的多种功能活性，对糖、脂肪代谢以及核酸、蛋白质的合成调节等起着重要的作用。环磷酸鸟苷有乙酰胆碱的作用，抑制心肌收缩力，降低心率，增加神经兴奋性，具有刺激白细胞溶酶体释放水解酶，刺激淋巴细胞分裂增殖，抑制糖异生以及兴奋副交感神经的功能。据测定，红枣里环磷酸腺苷(cAMP)是已经检测过的动植物中含量最高的，现检测到红枣中的cAMP含量可以高达553.55μg/g，同时还检测到环磷酸鸟苷(cGMP)，但其含量较cAMP低许多，最高为202.15μg/g。科学研究中，cAMP的获取来源主要有化学合成法、微生物发酵法以及溶剂提取法。化学合成法存在操作复杂，安全性较低的弊端，微生物发酵法合成产品的纯度较低。溶剂提取法是使用特定溶剂对天然植物中含有的cAMP进行提取，具有简单、安全、快速、提取量大的优点。但目前现有技术中从红枣中提取cAMP的工艺也存在着提取效率差和纯度低的问题，而且目前鲜有从枣中提取环磷酸鸟苷工艺的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题，是要提供一种枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的制备方法，旨在采用醇为提取液，以大孔吸附树脂柱层析分离、膜分离、制备液相色谱分离三种分离手段，简单高效地提取枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的制备方法，该制备方法按以下步骤顺序进行：（1）制备枣粗提物将枣果，去核，粉碎得枣粉末，将枣粉末按枣粉末与提取溶剂重量体积比1：6~10的比例加入提取溶剂中，进行加热加压提取15~30min或加热回流提取1~2h，提取温度为70℃~90℃，重复提取2~3次，合并提取液，减压浓缩，回收有机溶剂，得枣粗提物；（2）醇沉将步骤（1）中枣粗提物加入60%~80%乙醇水溶液中，2℃~8℃静置24~48h，过滤，上清液减压浓缩，得环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷粗提取物；（3）大孔树脂层析柱分离将步骤（2）的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷粗提取物加入大孔树脂层析柱中，上样量与分离材料体积比1：100~500，分离步骤为：首先用纯水洗至层析柱无色，再用2~5个柱体积的洗脱液洗脱，流速1~3个柱体积/小时，收集洗脱液，得到环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合提取物；（4）膜分离将步骤（3）中的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合提取物，采用纳滤膜过滤，上清液减压浓缩，回收有机溶剂，得环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合组分；（5）制备液相色谱分离将（4）环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合组分经制备液相色谱仪分离，分别收集环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷组分，分别得到环磷酸腺苷制备组分和环磷酸鸟苷制备组分。作为本专利技术的一种限定，所述步骤（1）中，提取溶剂为0~30%乙醇或甲醇水溶液。作为本专利技术的另一种限定，所述有机溶剂为乙醇或甲醇。作为本专利技术的第三种限定，所述步骤（3）中，洗脱液为含有0.1%~1%甲酸或乙酸的20%~40%乙醇或甲醇水溶液。作为本专利技术的第四种限定，所述步骤（3）中，大孔树脂为HPD722弱极性大孔吸附树脂。作为本专利技术的第五种限定，所述步骤（4）中纳滤膜的材质为聚砜、聚醚砜或芳香聚酰胺，截流分子量为500，工作压力为0.4~0.7MPa，温度为20~45℃，pH为2~6。本专利技术还有一种限定，步骤（5）中制备液相色谱的分离条件为以粒径5~10μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相，10~20%甲醇等度洗脱，色谱柱效为3000~10000塔板/米，色谱柱长为100mm~500mm，色谱柱内径为20mm~200mm。本专利技术由于采用了上述的技术方案，其与现有技术相比，所取得的技术进步在于：（1）本专利技术以醇为提取液，以大孔吸附树脂分离、膜分离、制备液相色谱分离三种分离手段，环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的提取效率高，纯度高。（2）本专利技术采用HPD722弱极性大孔吸附树脂，其使用寿命较长，洗脱效率高。（3）本专利技术还采用纳滤膜分离，用来截留分子量大于500的成分，从而进一步有效去除杂质。（4）本专利技术采用制备液相色谱分离，实行在线监测，针对性分离，分离效率高。本专利技术下面将结合具体实施例作进一步详细说明。附图说明图1环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷标准品的高效液相色谱图；图2环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷标准品的紫外吸收光谱图；图3环磷酸腺苷制备组分的高效液相色谱图；图4环磷酸腺苷制备组分的紫外吸收光谱图；图5环磷酸鸟苷制备组分的高效液相色谱图图6环磷酸鸟苷制备组分的紫外吸收光谱图；图7环磷酸腺苷标准品和环磷酸腺苷制备组分的质谱图；图8环磷酸鸟苷标准品和环磷酸鸟苷制备组分的质谱图。具体实施方式下述实施例中所用的试剂如无特殊说明均为现有市售试剂，试验方法如无特殊说明均采用现有的试验方法。实施例1一种枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的制备方法（1）制备枣粗提物将枣果，去核，粉碎得枣粉末，将枣粉末按枣粉末与提取溶剂重量体积比1：10的比例加入提取溶剂中，进行加热回流提取，提取溶剂为15%乙醇水溶液，提取温度为90℃，每次提取2h，重复提取2次，合并提取液，减压浓缩，回收乙醇，得枣粗提物；（2）醇沉将步骤（1）中枣粗提物加入75%乙醇水溶液中，4℃静置24h，过滤，上清液减压浓缩，得环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷粗提取物；（3）大孔树脂层析柱分离将步骤（2）的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷粗提取物加入HPD722弱极性大孔吸附树脂层析柱中，上样量与分离材料体积比1：200，分离步骤为：首先用纯水洗至层析柱无色，再用3个柱体积的含有0.1%甲酸的30%乙醇水溶液为洗脱液洗脱，流速1.5个柱体积/小时，收集洗脱液，回收乙醇，得到环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合提取物；（4）膜分离将步骤（3）中的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合提取物，采用纳滤膜过滤，纳滤膜为聚砜材质，截流分子量为500，工作压力为0.5MPa，温度为45℃，pH为4，上清液减压浓缩，回收乙醇，得环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合组分；（5）制备液相色谱分离将（4）环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合组分用甲醇溶解，经制备液相色谱仪分离，分离条件为以粒径5μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相，用20%甲醇等度洗脱，色谱柱效为8000塔板/米，色谱柱长为150mm，色谱柱内径为21.2mm，分别收集环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷组分，得到环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷，纯度分别为93.1%和94.4%。实施例2～11枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的制备方法实施例2～11分别为一种枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的制备方法，所述操作步骤均与实施例1相同，仅仅是醇的种类、纯度，以及过程中的反应时间、反应温度等控制参数不同，具体见下表：实施例12环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的定性实验采用三种方法联合对实施例1~11任一项所述制备得到的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷进行定性。方法一、高效液相色谱保留时间及紫外吸收光谱图进行定性检测仪器：高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器。检测条件：色谱柱：C18色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的制备方法，其特征在于：该制备方法按以下步骤顺序进行：（1）制备枣粗提物将枣果，去核，粉碎得枣粉末，将枣粉末按枣粉末与提取溶剂重量体积比1：6~10的比例加入提取溶剂中，进行加热加压提取15~30 min或加热回流提取1~2 h，提取温度为70℃~90℃，重复提取2~3次，合并提取液，减压浓缩，回收有机溶剂，得枣粗提物；（2）醇沉将步骤（1）中枣粗提物加入60%~80%乙醇水溶液中，2℃~8℃静置24~48 h，过滤，上清液减压浓缩，得环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷粗提取物；（3）大孔树脂层析柱分离将步骤（2）的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷粗提取物加入大孔树脂层析柱中，上样量与分离材料体积比1：100~500，分离步骤为：首先用纯水洗至层析柱无色，再用2~5个柱体积的洗脱液洗脱，流速1~3个柱体积/小时，收集洗脱液，得到环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合提取物；（4）膜分离将步骤（3）中的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合提取物，采用纳滤膜过滤，上清液减压浓缩，回收有机溶剂，得环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合组分；（5）制备液相色谱分离将（4）环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合组分经制备液相色谱仪分离，分别收集环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷组分，分别得到环磷酸腺苷制备组分和环磷酸鸟苷制备组分。...

【技术特征摘要】
1.一种枣果中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的制备方法，其特征在于：该制备方法按以下步骤顺序进行：（1）制备枣粗提物将枣果，去核，粉碎得枣粉末，将枣粉末按枣粉末与提取溶剂重量体积比1：6~10的比例加入提取溶剂中，进行加热加压提取15~30min或加热回流提取1~2h，提取温度为70℃~90℃，重复提取2~3次，合并提取液，减压浓缩，回收有机溶剂，得枣粗提物；（2）醇沉将步骤（1）中枣粗提物加入60%~80%乙醇水溶液中，2℃~8℃静置24~48h，过滤，上清液减压浓缩，得环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷粗提取物；（3）大孔树脂层析柱分离将步骤（2）的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷粗提取物加入大孔树脂层析柱中，上样量与分离材料体积比1：100~500，分离步骤为：首先用纯水洗至层析柱无色，再用2~5个柱体积的洗脱液洗脱，流速1~3个柱体积/小时，收集洗脱液，得到环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合提取物；（4）膜分离将步骤（3）中的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合提取物，采用纳滤膜过滤，上清液减压浓缩，回收有机溶剂，得环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合组分；（5）制备液相色谱分离将（4）环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合组分经制备液相色谱仪分离，分别收集环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷组分，分别得到环磷酸腺苷制备组分和环磷酸鸟苷制...

【专利技术属性】
技术研发人员：李存满，罗晓，田晶，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：河北,13