一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物制造技术

本发明专利技术涉及细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，可有效解决免疫逃逸、长循环，通过增强声疗联合NO化疗，促进肿瘤细胞凋亡的问题，其解决的技术方案是，中空介孔二氧化钛纳米粒表面通过酰胺化反应共价修饰血红蛋白，然后物理负载NO供体型化疗药物RRx‑001，最后与细胞经低渗裂解液和裂解处理、匀浆得到的细胞膜囊泡共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，本发明专利技术制备方法稳定可靠，生产费用低，制得的细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物在制备抗肿瘤药物方面可发挥增强声疗联合NO化疗的作用，增强抗肿瘤效果，同时具有免疫逃逸、长循环等多功能，生物相容性好，是肿瘤治疗药物上的创新。

Pharmaceutical Composition of Biomimetic Titanium Dioxide Nanoparticles on Cell Membrane

The present invention relates to the pharmaceutical composition of biomimetic titanium dioxide nanoparticles on cell membrane, which can effectively solve the problem of immune escape and long cycle, and promote the apoptosis of cancer cells through enhanced sonotherapy combined with NO chemotherapy. The technical solution is that the surface of hollow mesoporous titanium dioxide nanoparticles covalently modify hemoglobin through amidation reaction, and then physically load the NO donor-type chemotherapeutic drug RRx. In the end, the cell membrane biomimetic titanium dioxide nanoparticles can be obtained by co-extruding with the cell membrane vesicles obtained by the cell lysate, lysis and homogenization. The preparation method of the present invention is stable and reliable, and the cost of production is low. The prepared cell membrane biomimetic titanium dioxide nanoparticles can play an important role in the preparation of anti-cancer drugs by enhanced sonotherapy combined with NO chemotherapy. It has many functions, such as immune escape, long circulation and so on. It has good biocompatibility. It is an innovation in cancer treatment drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物
本专利技术涉及生物医药领域，特别是一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物。
技术介绍
声动力学治疗(SonodynamicTherapy，SDT)是声敏剂被超声波激发而产生活性氧(ROS)，从而发挥抗肿瘤效应的手段。中空介孔二氧化钛纳米粒(TiO2)作为声敏剂具有生物相容性好、化学稳定性高、比表面积大等优点。但声疗是氧气依赖性的，而肿瘤部位乏氧，严重削弱了SDT的效果。血红蛋白(Hb)是红细胞中运输氧气的重要蛋白质，具有可逆的氧气结合与解离能力；同时脱氧Hb还具有亚硝酸盐还原酶活性，可以将亚硝酸盐还原为NO。化疗药RRx-001作为一种抗癌新药，也是一种NO供体，可增强脱氧Hb的亚硝酸盐还原酶活性，进一步增加肿瘤NO的产生，促进细胞凋亡。通过细胞膜包覆纳米粒，可完整保留细胞膜表面的复杂组成成分，不同的细胞膜修饰纳米粒后的功能不同，可提高纳米粒的生物相容性，实现免疫逃逸、长循环、主动靶向等，赋予纳米粒多功能的特征。因此，专利技术一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物应用在癌症治疗中具有重大意义和价值。
技术实现思路
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，可有效解决免疫逃逸、长循环，通过增强声疗联合NO化疗，促进肿瘤细胞凋亡的问题。本专利技术解决的技术方案是，中空介孔二氧化钛纳米粒表面通过酰胺化反应共价修饰血红蛋白，然后物理负载NO供体型化疗药物RRx-001，最后与细胞经低渗裂解液和裂解处理、匀浆得到的细胞膜囊泡共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，粒径为140-200nm。具体包括以下步骤：1)将0.6-1mL的正硅酸四乙酯(TEOS)加到装有0.3-0.5mL超纯水、15-25mL无水乙醇和0.6-1mL氨水的烧瓶中，强烈搅拌10-14h，10000-15000rpm离心10-20min，用无水乙醇洗至中性，得二氧化硅纳米粒(SiO2)；2)将步骤1)制得的二氧化硅纳米粒分散在10-20mL无水乙醇和0.05-0.15mL超纯水制成的溶液中，然后加入溶于2.5-7.5mL无水乙醇的0.05-0.15g羟丙基纤维素搅拌30min，成混合溶液，将0.5-1.5mL叔丁醇钛溶于2.5-7.5mL无水乙醇后，缓慢滴加到混合溶液中，80-90℃回流90-110min，10000-15000rpm离心10-20min，用无水乙醇洗2-4次，得SiO2@TiO2复合物；3)将步骤2)中制得的SiO2@TiO2复合物分散于15-25mL超纯水中，加0.1-0.3gPVPk30，搅拌10-14h，10000-15000rpm离心5-10min得沉淀，沉淀再分散于15-25mL无水乙醇中，加入0.3-0.5mL超纯水、0.6-1mLTEOS和0.6-1mL氨水，磁力搅拌3-5h，10000-15000rpm离心5-10min，用无水乙醇洗至中性，得SiO2@TiO2@SiO2复合物；4)将步骤3)中制得的SiO2@TiO2@SiO2复合物研磨后，于马弗炉中400℃煅烧2-4h，再分散于30-50mL超纯水中，加1.5-2.5mL2.5M的氢氧化钠溶液，80-90℃回流搅拌6-8h，10000-15000rpm离心5-10min，用超纯水洗至中性，得中空介孔二氧化钛纳米粒(TiO2)；5)将步骤4)制得的中空介孔二氧化钛纳米粒(TiO2)10-50mg分散于4-20mL无水乙醇，加入80-400μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，再加入0.2-1mL超纯水和0.2-1mL氨水，25℃搅拌10-14h，10000-15000rpm离心5-10min，用无水乙醇洗至中性，得氨基化的中空介孔二氧化钛复合物(TiO2-NH2)；6)将5-50mg血红蛋白(Hb)溶解于10mL溶剂中，加入10-50mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和8-38mgN-羟基琥珀酰亚胺，25℃搅拌30min后，滴入含有步骤(5)制得的5mg氨基化的中空介孔二氧化钛复合物(TiO2-NH2)的5mL溶剂分散液中，反应4-12h，5000-10000rpm离心5-10min，用超纯水洗至中性，得血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛(Hb-TiO2)；所述的血红蛋白为人血红蛋白、牛血红蛋白或重组血红蛋白的一种；所述的溶剂为甲酰胺、PBS、MES的一种；7)将1mg步骤6)中制得的血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛(Hb-TiO2)和0.5-4mgRRx-001(NO供体型化疗药物)分散于5mL甲醇中，25℃下超声2-4h，随即40-50℃旋蒸，挥干甲醇，再加1-2ml甲醇超声2-4s复溶，10000-15000rpm离心5-10min，得血红蛋白修饰的负载RRx-001的二氧化钛药物复合物(Hb-TiO2/RRx-001)，RRx-001的载药量为20％～60％；8)消化收集贴壁细胞，加入低渗裂解液后对细胞进行裂解处理，机械或手动匀浆后，4℃3000-3500g离心5min，收集上清，再于4℃10000-15000g离心20-40min，沉淀加超纯水0.5mL重悬，使用挤压器通过400nm聚碳酸酯膜挤压15-25次，得细胞膜(CM)囊泡溶液；再与步骤7)制得的血红蛋白修饰的负载RRx-001的二氧化钛药物复合物(Hb-TiO2/RRx-001)通过200nm聚碳酸酯膜共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物(CM-Hb-TiO2/RRx-001)；所述的细胞为乳腺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、红细胞、单核细胞、巨噬细胞的一种；所述的低渗裂解液为Tris-HCl(20mM)、KCl(10mM)、MgCl2(2mM)和苯甲基磺酰氟(PMSF，1mM)的混合液，裂解处理为4℃放置1～3h、液氮和25℃反复冻融2～4次，每次置液氮中3S，25℃融化。本专利技术制备方法稳定可靠，生产费用低，制得的细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物在制备抗肿瘤药物方面可发挥增强声疗联合NO化疗的作用，增强抗肿瘤效果，同时具有免疫逃逸、长循环等多功能，生物相容性好，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。实施例11)将0.8mL的正硅酸四乙酯(TEOS)加到装有0.4mL超纯水、20mL无水乙醇和0.8mL氨水的烧瓶中，强烈搅拌12h，12000rpm离心15min，用无水乙醇洗至中性，得二氧化硅纳米粒(SiO2)；2)将步骤1)制得的二氧化硅纳米粒分散在15mL无水乙醇和0.1mL超纯水制成的溶液中，然后加入溶于5mL无水乙醇的0.1g羟丙基纤维素搅拌30min，成混合溶液，将1mL叔丁醇钛溶于5mL无水乙醇后，缓慢滴加到混合溶液中，85℃回流100min，12000rpm离心15min，无水乙醇洗3次，得SiO2@TiO2复合物；3)将步骤2)中制得的SiO2@TiO2复合物分散于20mL超纯水中，加0.2gPVPk30，搅拌12h，12000rpm离心8min得沉淀，再分散于20mL无水乙醇中，加入0.4mL超纯水、0.8mLTEOS和0.8mL氨水，磁力搅拌4h，12000rpm离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物的制备方法，其特征在于，中空介孔二氧化钛纳米粒表面通过酰胺化反应共价修饰血红蛋白，然后物理负载NO供体型化疗药物RRx‑001，最后与细胞经低渗裂解液和裂解处理、匀浆得到的细胞膜囊泡共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，粒径为140‑200nm，具体包括以下步骤：1）将0.6‑1mL的正硅酸四乙酯加到装有0.3‑0.5mL超纯水、15‑25mL无水乙醇和0.6‑1mL氨水的烧瓶中，强烈搅拌10‑14h，10000‑15000rpm离心10‑20min，用无水乙醇洗至中性，得二氧化硅纳米粒；2）将步骤1）制得的二氧化硅纳米粒分散在10‑20mL无水乙醇和0.05‑0.15mL超纯水制成的溶液中，然后加入溶于2.5‑7.5mL无水乙醇的0.05‑0.15g羟丙基纤维素搅拌30min，成混合溶液，将0.5‑1.5mL叔丁醇钛溶于2.5‑7.5mL无水乙醇后，缓慢滴加到混合溶液中，80‑90℃回流90‑110min，10000‑15000rpm离心10‑20min，用无水乙醇洗2‑4次，得SiO2@TiO2复合物；3）将步骤2）中制得的SiO2@TiO2复合物分散于15‑25mL超纯水中，加0.1‑0.3gPVPk30，搅拌10‑14h，10000‑15000rpm离心5‑10min得沉淀，沉淀再分散于15‑25mL无水乙醇中，加入0.3‑0.5mL超纯水、0.6‑1mLTEOS和0.6‑1mL氨水，磁力搅拌3‑5h，10000‑15000rpm离心5‑10min，用无水乙醇洗至中性，得SiO2@TiO2@SiO2复合物；4）将步骤3）中制得的SiO2@TiO2@SiO2复合物研磨后，于马弗炉中400℃煅烧2‑4h，再分散于30‑50mL超纯水中，加1.5‑2.5mL2.5M的氢氧化钠溶液，80‑90℃回流搅拌6‑8h，10000‑15000rpm离心5‑10min，用超纯水洗至中性，得中空介孔二氧化钛纳米粒；5）将步骤4）制得的中空介孔二氧化钛纳米粒10‑50mg分散于4‑20mL无水乙醇，加入80‑400μL3‑氨丙基三乙氧基硅烷，再加入0.2‑1mL超纯水和0.2‑1mL氨水，25℃搅拌10‑14h，10000‑15000rpm离心5‑10min，用无水乙醇洗至中性，得氨基化的中空介孔二氧化钛复合物；6）将5‑50mg血红蛋白溶解于10mL溶剂中，加入10‑50mg1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和8‑38mgN‑羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min后，滴入含有步骤5）制得的5mg氨基化的中空介孔二氧化钛复合物的5mL溶剂分散液中，反应4‑12h，5000‑10000rpm离心5‑10min，用超纯水洗至中性，得血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛；所述的血红蛋白为人血红蛋白、牛血红蛋白或重组血红蛋白的一种；所述的溶剂为甲酰胺、PBS、MES的一种；7）将1mg步骤6）中制得的血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛和0.5‑4mgRRx‑001分散于5mL甲醇中，25℃下超声2‑4h，随即40‑50℃旋蒸，挥干甲醇，再加1‑2ml甲醇超声2‑4s复溶，10000‑15000rpm离心5‑10min，得血红蛋白修饰的负载RRx‑001的二氧化钛药物复合物，RRx‑001的载药量为20%～60%；8）消化收集贴壁细胞，加入低渗裂解液后对细胞进行裂解处理，机械或手动匀浆后，4℃3000‑3500g离心5min，收集上清，再于4℃10000‑15000g离心20‑40min，沉淀加超纯水0.5mL重悬，使用挤压器通过400nm聚碳酸酯膜挤压15‑25次，得细胞膜囊泡溶液；再与步骤7）制得的血红蛋白修饰的负载RRx‑001的二氧化钛药物复合物通过200nm聚碳酸酯膜共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物；所述的细胞为乳腺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、红细胞、单核细胞、巨噬细胞的一种；所述的低渗裂解液为20mMTris‑HCl、10mMKCl、2mMMgCl2和1mMPMSF的混合液，裂解处理为4℃放置1~3h、液氮和25℃反复冻融2~4次，每次置液氮中3S，25℃融化。...

【技术特征摘要】
1.一种细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物的制备方法，其特征在于，中空介孔二氧化钛纳米粒表面通过酰胺化反应共价修饰血红蛋白，然后物理负载NO供体型化疗药物RRx-001，最后与细胞经低渗裂解液和裂解处理、匀浆得到的细胞膜囊泡共挤压，即得细胞膜仿生二氧化钛纳米粒的药物组合物，粒径为140-200nm，具体包括以下步骤：1）将0.6-1mL的正硅酸四乙酯加到装有0.3-0.5mL超纯水、15-25mL无水乙醇和0.6-1mL氨水的烧瓶中，强烈搅拌10-14h，10000-15000rpm离心10-20min，用无水乙醇洗至中性，得二氧化硅纳米粒；2）将步骤1）制得的二氧化硅纳米粒分散在10-20mL无水乙醇和0.05-0.15mL超纯水制成的溶液中，然后加入溶于2.5-7.5mL无水乙醇的0.05-0.15g羟丙基纤维素搅拌30min，成混合溶液，将0.5-1.5mL叔丁醇钛溶于2.5-7.5mL无水乙醇后，缓慢滴加到混合溶液中，80-90℃回流90-110min，10000-15000rpm离心10-20min，用无水乙醇洗2-4次，得SiO2@TiO2复合物；3）将步骤2）中制得的SiO2@TiO2复合物分散于15-25mL超纯水中，加0.1-0.3gPVPk30，搅拌10-14h，10000-15000rpm离心5-10min得沉淀，沉淀再分散于15-25mL无水乙醇中，加入0.3-0.5mL超纯水、0.6-1mLTEOS和0.6-1mL氨水，磁力搅拌3-5h，10000-15000rpm离心5-10min，用无水乙醇洗至中性，得SiO2@TiO2@SiO2复合物；4）将步骤3）中制得的SiO2@TiO2@SiO2复合物研磨后，于马弗炉中400℃煅烧2-4h，再分散于30-50mL超纯水中，加1.5-2.5mL2.5M的氢氧化钠溶液，80-90℃回流搅拌6-8h，10000-15000rpm离心5-10min，用超纯水洗至中性，得中空介孔二氧化钛纳米粒；5）将步骤4）制得的中空介孔二氧化钛纳米粒10-50mg分散于4-20mL无水乙醇，加入80-400μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，再加入0.2-1mL超纯水和0.2-1mL氨水，25℃搅拌10-14h，10000-15000rpm离心5-10min，用无水乙醇洗至中性，得氨基化的中空介孔二氧化钛复合物；6）将5-50mg血红蛋白溶解于10mL溶剂中，加入10-50mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和8-38mgN-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min后，滴入含有步骤5）制得的5mg氨基化的中空介孔二氧化钛复合物的5mL溶剂分散液中，反应4-12h，5000-10000rpm离心5-10min，用超纯水洗至中性，得血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛；所述的血红蛋白为人血红蛋白、牛血红蛋白或重组血红蛋白的一种；所述的溶剂为甲酰胺、PBS、MES的一种；7）将1mg步骤6）中制得的血红蛋白修饰的中空介孔二氧化钛和0.5-4mgRRx-001分散于5mL甲醇中，25℃下超声2-4h，随即40-50℃旋蒸，挥干甲醇，再加1-2ml甲醇超声2-4s复溶，10000-15000rpm离心5-10min，得血红蛋白修饰的负载RRx-001的二氧化钛药物复合物，RRx-001的载药量为20%～60%；8）消化收集贴壁细胞，加入低渗裂解液后对细胞进行裂解处理，机械或手动匀浆后，4℃3000-3500g离心5min，收集上清，再于4℃10000-15000g离心20-40min，沉淀加超纯水0.5mL重悬，使用挤压器通过400nm聚碳酸酯膜挤压15-25次，得细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯倩华，张振中，李玉真，郝雨桐，王宁，张红岭，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南,41