一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液及染色脱色方法技术

本发明专利技术公开了一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液及染色脱色方法，该低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液含有0.005％‑0.02％考马斯亮蓝、1％‑5％(v/v)的浓盐酸或1％‑5％(v/v)85％磷酸、1％‑5％(v/v)的冰乙酸、1.5‰‑5‰的无水硫酸铜/三氯化铬、3％‑5％(v/v)的无水乙醇的混合水溶液。本发明专利技术具有染色液低毒、低刺激、染色脱色时间短、染色分辨率和色牢度高等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液及染色脱色方法
本专利技术涉及分子生物学技术和蛋白质学
，主要是涉及一种应用于蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的考马斯亮蓝快速染色液和染色脱色方法。
技术介绍
聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE)已成为现代生物学研究中重要的技术手段，是对蛋白质进行纯度及含量鉴定的一种经济、快速、可重复的方法。SDS-PAGE电泳易于操作、用途广泛，已成为许多研究领域中一种重要的分析技术，SDS-PAGE包括四个主要步骤，即：凝胶制备、电泳、染色、脱色。其中凝胶制备和电泳已有成熟的技术和专用设备，目前，市场常见的用于凝胶染色脱色的产品，主要存在以下缺陷：1)灵敏度和分辨率较低，且脱色时间不容易控制，脱色后凝胶染色结果不容易保存；2)灵敏度较高的硝酸银染色法，其染色步骤复杂，染色过程污染较大，染色所用试剂原料成本较高；3)荧光染色法和负染法的染色试剂成本较高，且需要使用特殊的仪器进行检测分析，目前普及和使用率均较低。考马斯亮蓝为一种三苯甲烷类染料，可与蛋白质通过范德华力作用形成较强的非共价复合体。考马斯亮蓝染色法以其较高的重复性和灵敏度以及很好的质谱兼容性，成为目前一种使用较为广泛的蛋白质染色方法，其在一定范围内和蛋白浓度呈正比，因此也用于蛋白定量检测。考马斯亮蓝分为G250和R250两种。其中，考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，且形成有色复合体较为稳定不容易洗脱，常被用于蛋白定量检测，然而其脱色时间较长、脱色困难，背景较高且较难脱色彻底，长时间的水中脱色容易使凝胶吸水膨胀甚至破碎；考马斯亮蓝R250灵敏度高但与蛋白质反应比较缓慢，染色脱色耗时较长，染色液中所含的甲醇、异丙醇、乙酸等大量挥发对人体呼吸道等有较大的危害。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供了一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液及快速染色脱色方法，具有染色液低毒、低刺激、染色脱色时间短、染色分辨率和色牢度高等优势。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液，包括：优选地，所述浓盐酸或85％磷酸的体积百分比为3％。优选地，所述无水硫酸铜或三氯化铬的质量体积百分数为2.5‰。本专利技术还提供了一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液的制备方法，包括：1)称取0.05-0.2g的考马斯亮蓝G-250，加入30-50ml的无水乙醇或异丙醇搅拌至溶解完全；2)加入1.5-5g无水硫酸铜或三氯化铬，加入500-800ml超纯水，以200-600rpm/min的速度搅拌0.5-2小时；3)加入10-50ml的冰乙酸搅拌至均匀，然后加入10-50ml浓盐酸或85％磷酸搅拌均匀；4)加入超纯水定容至1L，去除沉淀后即可获得染色液。优选地，步骤2)中加入700ml超纯水，以200-600rpm/min的速度搅拌1小时。优选地，步骤4)中采用高速离心，或是负压抽滤的方式去除沉淀。本专利技术在前述的低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液基础上，同时提供一种快速染色脱色方法，所述快速染色脱色方法包括如下步骤：1)采用考马斯亮蓝快速染色液完全覆盖凝胶表面，加热煮沸2-3min；2)取出凝胶用超纯水冲洗凝胶表面残留染液(此时在目的蛋白量较大情况下即可初步看到染色条带)，然后加入超纯水加热煮沸3-5min，完成初步脱色(此时可以清晰观察到染色蛋白条带，但凝胶背景色并未完全脱净)；3)取出初步脱色后的凝胶加入100-500mMNaCl水溶液，水平摇床30-60rpm/min室温脱色0.5-1.5h，完成彻底脱色。优选地，所述凝胶在进行步骤1)的染色之前，先加入超纯水清洗凝胶，再次加入超纯水加热至沸腾后取出凝胶并沥干凝胶上的水分。优选地，步骤1)中，将凝胶放入有盖耐热容器后加入考马斯亮蓝快速染色液使其完全覆盖凝胶表面，再使用微波炉中高火加热煮沸2-3min。优选地，步骤3)中，水平摇床50rpm/min室温脱色1h。本专利技术具有的有益效果是：1.较传统的考马斯亮蓝染色法的成本低，分辨率高，在保证染色效果同时染色液中所含的有毒和刺激性成分更低，同时染色脱色时间大大缩短，传统方法染色脱色约2-3h，本染色液和染色方法最快10min可初步观察结果，彻底脱去背景色总用时约1.5h。2.本染色液较目前市场上的快速染色液，染色脱色时间相同，但染色分辨率和色牢度更高，同时染色液成本仅为市场上的快速染色液的十分之一。附图说明图1(a)为本专利技术含有质量体积百分数0.005％考马斯亮蓝CCB-G250的染色液的染色结果；图1(b)为本专利技术含有质量体积百分数0.02％考马斯亮蓝CCB-G250的染色液的染色结果；图1(c)为本专利技术含有质量体积百分数0.1％考马斯亮蓝CCB-G250的染色液的染色结果。图2(a)为本专利技术含有乙醇的考马斯亮蓝染色液的染色结果；图2(b)为含有甲醇的考马斯亮蓝染色液的染色结果；图2(c)为含有异丙醇的考马斯亮蓝染色液的染色结果。图3(a)为本专利技术不含硫酸铜/三氯化铬的考马斯亮蓝染色液的染色结果；图3(b)为含有2.5‰硫酸铜/三氯化铬的考马斯亮蓝染色液的染色结果；图3(c)为含有5‰硫酸铜/三氯化铬的考马斯亮蓝染色液的染色结果。图4(a)为市售某品牌快速染色液电泳结束后立即染色结果；图4(b)为市售某品牌快速染色液染色完成后纯水浸泡72h、每天换水一次后的染色结果；图4(c)为本专利技术考马斯亮蓝快速染色液电泳结束后立即染色结果；图4(d)为本专利技术考马斯亮蓝快速染色液染色完成后纯水浸泡72h、每天换水一次后的染色结果。图5(a)为传统考马斯亮蓝染色效果(R250)的染色结果；图5(b)为市售某品牌快速染色液的染色结果；图5(c)为本专利技术考马斯亮蓝快速染色液的染色结果。图6为采用本专利技术的考马斯亮蓝快速染色液染色的一种重组蛋白亲和层析纯化结果。图7为采用本专利技术的考马斯亮蓝快速染色液染色的另一种重组蛋白亲和层析纯化结果。图8为彩虹180广谱蛋白Marker(11-180KD)，PN：PR1910，索莱宝的电泳条带示意图。具体实施方式为了使公众能充分了解本专利技术的技术实质和有益效果，申请人将结合实施例对本专利技术做进一步详细描述，但申请人对实施例的描述并非对技术方案的限制，任何依据本专利技术构思作形式而非实质的变化都应当视为涵盖在本专利技术的保护范围之内。以下实施例中低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液采用以下方法制备：1)称取0.05-0.2g的考马斯亮蓝G-250，加入30-50ml的无水乙醇搅拌至溶解完全；2)加入1.5-5g无水硫酸铜或三氯化铬，加入500-800ml超纯水，利用磁力搅拌器以200-600rpm/min的速度搅拌0.5-2小时；3)加入10-50ml的冰乙酸搅拌至均匀，然后加入10-50ml浓盐酸(也可采用85％磷酸，效果相同)搅拌均匀；4)加入超纯水定容至1L，采用10000rpm高速离心5min(也可使用普通定性滤纸负抽滤的方式，对最终结果无影响)去除沉淀后即可获得染色液。除色牢度检测实验之外，以下各实施例中采用的染色脱色方法如下：1.清洗：聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出胶板，切割舍弃浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液，包括：

【技术特征摘要】
1.一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液，包括：2.根据权利要求1所述的一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液，其特征在于，所述浓盐酸或85％磷酸的体积百分比为3％。3.根据权利要求1所述的一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液，其特征在于，所述无水硫酸铜或三氯化铬的质量体积百分数为2.5‰。4.一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液的制备方法，包括：1)称取0.05-0.2g的考马斯亮蓝G-250，加入30-50ml的无水乙醇或异丙醇搅拌至溶解完全；2)加入1.5-5g无水硫酸铜或三氯化铬，加入500-800ml超纯水，以200-600rpm/min的速度搅拌0.5-2小时；3)加入10-50ml的冰乙酸搅拌至均匀，然后加入10-50ml浓盐酸或85％磷酸继续搅拌均匀；4)去除沉淀后即可获得染色液。5.根据权利要求4所述的一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液的制备方法，其特征在于，步骤2)中加入700ml超纯水，以200-600rpm/min的速度搅拌1小时。6.根据权利要求4所述的一种低毒低刺激的考马斯...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠丹，戴敬，杨晟，姜坤廷，李莹玉，
申请(专利权)人：苏州译酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32