一种脂肪酶在拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种脂肪酶在拆分N‑乙酰‑DL‑甲硫氨酸甲酯中的应用，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌工程菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得重组脂肪酶；该重组脂肪酶具有催化拆分N‑乙酰‑DL‑甲硫氨酸甲酯的能力，可以获得N‑乙酰‑L‑蛋氨酸甲酯，对映体过量值>99％和转化率达到51.2％。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪酶在拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯中的应用(一)
本专利技术属于生物催化
，涉及一种脂肪酶立体选择性催化水解拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯对映体合成单一构型的N-乙酰-L-甲硫氨酸甲酯对映体的应用。(二)
技术介绍
N-乙酰-L-甲硫氨酸(N-Ac-L-Met)是一种有价值的营养补充剂，由L-甲硫氨酸(L-Met)的化学乙酰化产生，通过酰基转移酶催化N-乙酰-DL-甲硫氨酸(N-Ac-DL-Met)的拆分制备。DL-Met是用于N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯(N-Ac-DL-MetOMe)生产的材料，通过化学合成以低成本大规模生产。已经提出了酶催化N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯的水解用于N-Ac-L-Met生产。在这个过程中，将生产N-Ac-L-Met和D-Met，它们可用作药物的非手性合成物或原料。但是，由于反应的对映体选择性差，N-Ac-L-Met的产率低，迄今为止没有开发出有效的解决方法。因此，我们提供了一种脂肪酶催化水解拆分N-Ac-DL-MetOMe来高效生产N-Ac-L-MetOMe的有效方法。酶法拆分能够利用酶的高度立体、位点、区域选择性，催化化学合成的外消旋体或衍生物中的某一对映体进行水解以获得高产率、高选择性的单一对映体，具有选择性高、反应条件温和、反应较稳定及易于工业化的特点。同时，酶法拆分可以解决化学合成易造成环境污染，产生大量无效甚至对环境有害的对映体问题，对于保护人类的自然环境和健康具有极为重要的意义。脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)全称为三酰基甘油酰基水解酶(Triacyl-glycerolacylhydrolase)，是目前研究与工业化应用最多的一类水解酶。脂肪酶能催化酯水解、酯合成、醇解、酸解、酯酯交换和氨解反应。脂肪酶广泛存在于自然界的各种生物体，特别是在微生物和动植物组织中。动物脂肪酶主要存在于胰脏等器官组织，比如猪肝酯酶和猪胰脂肪酶，但由于动物脂肪酶活性较低、酶提取纯化成本较高和原料来源有限等因素，限制了其在工业中的应用。微生物脂肪酶来源丰富，种类繁多，不受季节气候等因素的影响，微生物生长产酶周期较短，而且具有耐有机溶剂、底物专一性强、催化选择性高和催化活性高等特点，因而微生物来源的脂肪酶有较高的工业化应用价值。目前市场上大部分商品化脂肪酶都通过细菌、真菌和酵母等微生物培养发酵获得。丹麦NovoNordisk公司、日本Amano公司和美国Genencor公司等主要酶制造商开发了多种的商品化酶制剂。这些酶制剂公司利用分子改造技术对微生物脂肪酶进行改造，提高酶活力、稳定性和立体选择性等酶学性质，以满足不同工业领域应用的需求。因而构建脂肪酶基因工程菌从而大量生产重组脂肪酶具有十分重要意义。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种立体选择性脂肪酶在生物法拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯中的应用，利用脂肪酶可以高效拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯，得到高纯度N-乙酰-L-甲硫氨酸甲酯，提高产率。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种脂肪酶在拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯中的应用(如图2所示)，所述脂肪酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示，具体的应用方法为：以含立体选择性脂肪酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冻干粉为催化剂，以N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯为底物，以pH7.0缓冲液为反应介质，在25-45℃、600-800rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得N-乙酰-L-甲硫氨酸甲酯。所述催化剂用量以缓冲液体积计为10g/L，所述底物终浓度以缓冲液体积计为5-20g/L。进一步，优选反应时间为2-60min，更优选反应条件为35℃、800rpm反应10min。进一步，所述缓冲液为pH7.0，0.2mM的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲溶液。进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含立体选择性脂肪酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌BL21)接种在LB培养基中，37℃培养OD600至0.4-0.6(优选0.5)，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h，菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，冻干，得到脂肪酶粗酶粉，即湿菌体冻干粉；所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。进一步，本专利技术所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，反应液用4mMHCl酸化至pH2.0，然后用等体积乙酸乙酯萃取，分液漏斗分离出有机相(优选分液漏斗分离出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，将有机相经纯水洗涤两次)，再经纯水洗涤两次，饱和NaCl洗涤两次，将洗涤后得到的有机相用无水硫酸镁进行干燥，除去水后，再将有机相旋蒸至干，得到最终产物N-乙酰-L-甲硫氨酸甲酯。本专利技术立体选择性脂肪酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。MTINYHELETSHGRIAVRESEGEGAPLLMIHGNSSSGAVFAPQLEGEIGKKWRVISPDLPGHGKSSDAIDPEHSYSMEGYADAMTEVMQKLGIADAVVFGWSLGGHIGIEMIARYPEMRGLMITGTPPVAREEVGQGFKSGPDMALAGQEVFSERDVDSYARSTCGEPFEASLLDIVARTDGRARRIMFEKFGNGTGGNQRDIVAQAKLPIAVVNGRDEPFVELDFVSKVKFGNLWEGKTHVIDNAGHAPFRETPAIFDRYLMRFLSDCTIG。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQIDNO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本专利技术保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本专利技术所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本专利技术所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(Ⅲ)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本专利技术的蛋白可以是糖基化的。本专利技术的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本专利技术还涉及所述立体选择性脂肪酶的编码基因，具体的，所述大肠杆菌密码子优化后的编码基因核苷酸序列如S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪酶在拆分N‑乙酰‑DL‑甲硫氨酸甲酯中的应用，其特征在于所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶在拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯中的应用，其特征在于所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述脂肪酶编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含脂肪酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冻干粉为催化剂，以N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯为底物，以pH7.0缓冲液为反应介质，在25-45℃、600-800rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得N-乙酰-L-甲硫氨酸甲酯。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以缓冲液体积计为10g/L，所述底物终浓度以缓冲液体积计为5-20g/L。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于反应时间为2-60min。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应条件为35℃、800rpm反应1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑建永，吴鹏，章银军，孙杰，汪钊，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33