一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法拆分制备N‑甲基‑D‑天冬氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶基因构建于pMA5‑YwbN‑trsox质粒，并转化Bacillus subtilis WB600细胞中进行分泌性表达；(2)将转入pMA5‑YwbN‑trsox基因质粒的Bacillus subtilis WB600细胞进行发酵，获得的培养液上清与N‑甲基‑DL‑天冬氨酸溶液混合，针对N‑甲基‑L‑天冬氨酸进行具有手性选择性的生物催化；(3)采用等电点结晶法分离得到N‑甲基‑D天冬氨酸。

【技术实现步骤摘要】
一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其是涉及一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法。
技术介绍
N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)是动物机体中天然存在的一种氨基酸衍生物，分子式为C5H9NO4，分子量为147.13，是哺乳动物中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质L-谷氨酸同系物。NMDA一般仅存在于人和动物的神经和内分泌组织中，参与下丘脑-垂体生长轴的调控分泌作用，可明显提高细胞内的Ca2+水平，并使cAMP浓度降低；NMDA也可参与神经内分泌的调节中起重要作用，显著促进动物机体生长激素(GH)的分泌；通过抑制PC12细胞DNA合成而影响细胞的增殖活性，可用于抗肿瘤药物的合成。能够显著促进动物腺垂体中生长激素、黄垂体生成素、促性腺激素释放以及催乳素的分泌，是一种高效促生长的新型饲料添加剂。目前，NMDA已被开发作为一种新的功能性食品添加剂。目前，N-甲基-D-天冬氨酸主要以化学法合成。其中，蒋光玉等人的论文(精细与专用化学品，2011,19(1):45-48)中采用了直接甲基化方法，以D-天冬氨酸为原料，经酯化反应合成D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐，D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐在DMF溶剂中与碘甲烷反应生产N-甲基-D-天冬氨二甲酯，进一步在碱性条件下水解生成N-甲基-D-天冬氨酸。该方法反应步骤较多，且产品不易分离。此后，蒋光玉等人的专利(CN201110427732.5)中采用还原胺法，以D-天冬氨酸为原料，过量多聚甲醛、以及还原剂(氰基硼氢化钠)在甲醇溶剂中反应，得到N-甲基-D-天冬氨酸。朱高峰等人的论文(化学试剂，2016,38(3),280-283)中采用了以D-天冬氨酸为原料，依次通过酯化、酰化、N-甲基化和水解四步反应制得目标化合物。化学法合成N-甲基-D-天冬氨酸主要存在步骤较多、操作复杂、试剂毒性较大等缺陷。在黄建坡等人的专利(201210130205.2)中，利用一种能够表达N-甲基-L-天冬氨酸-β-脱羧酶的假单胞菌，特异性的将N-甲基-L-天冬氨酸转化为N-甲基-L-丙氨酸，从而完成N-甲基-D-天冬氨酸的手性拆分。但假单胞菌存在潜在的致病性。以上研究均存在一定的缺陷，为此，有必要开拓思路，寻找更为高效稳定的提取方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法。本专利技术方法所用宿主菌BacillussubtilisWB600具有较好的生物安全性，反应条件温和，步骤简单，产物分离快速，且具有较高的回收率。本专利技术的技术方案如下：一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将Thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶基因构建于pMA5-YwbN-trsox质粒，并转化BacillussubtilisWB600细胞中进行分泌性表达；(2)将转入pMA5-YwbN-trsox基因质粒的BacillussubtilisWB600细胞进行发酵，获得的培养液上清与N-甲基-DL-天冬氨酸溶液混合，针对N-甲基-L-天冬氨酸进行具有手性选择性的生物催化；(3)采用等电点结晶法分离得到N-甲基-D天冬氨酸。所述pMA5-YwbN-trsox质粒质粒的基因序列如SEQIDNO.1所示。所述pMA5-YwbN-trsox质粒转化BacillussubtilisWB600细胞的方法为：使用TB培养基，发酵温度为30-50℃，发酵时间为36-72h。步骤(2)中所述手性选择性生物转化的方法为：Thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶针对N-甲基-L-天冬氨酸进行具有手性选择性的催化时，pH值为6-8，温度为40-70℃，时间为12-36h。步骤(3)所述等电点结晶法的具体过程为，酶转化结束后，加入0.2-0.5w/v％的明矾在60℃絮凝2h，板框过滤去除絮凝物，使用浓硫酸将溶液pH值调节至2-4，将N-甲基-D-天冬氨酸洁净析出，并进行一次重结晶。所述Thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶基因(GenebankID：ACM06094.1)经过密码子优化，与YwbN分泌信号肽连接，构建于pMA5-YwbN-trsox质粒。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术利用培养BacillussubtilisWB600细胞，分泌性表达具有极端环境耐受性的Thermomicrobiumroseum来源肌氨酸氧化酶，对底物具有很强的手性选择性，能够特异性的识别N-甲基-L-氨基酸并完成N-甲基的脱除，但不对N-甲基-D-天冬氨酸起作用(图2)。以N-甲基-DL-天冬氨酸混合物为底物，在pH值为6-9，温度为40-70℃，反应时间为12-36h的温和条件下，快速拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸，光学纯度接近100％，产物回收率约90％。附图说明图1为pMA5-YwbN-trsox质粒的构建。图2为Thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶(TrSOX)催化产物的薄层层析图谱。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术进行具体描述。图1为pMA5-YwbN-trsox质粒的构建，TrSOX基因序列前端融合分泌表达信号肽YwbN序列，并通过NdeI与MluI两个限制性内切酶酶切位点链接如下pMA5质粒。图2为Thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶(TrSOX)催化产物的薄层层析图谱，由图2可以看出，TrSOX能够有效的将N-甲基-L-天冬氨酸(N-Methyl-L-Asp)转化为L-天冬氨酸(L-Asp)产物；而不能作用于N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Asp)，不能产生D-天冬氨酸(D-Asp)产物；因此，TrSOX可以完成N-甲基-DL-天冬氨酸混合物中，N-甲基-D-天冬氨酸的手性拆分。实施例1：一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：1)将转化入pMA5-YwbN-trsox质粒(SEQIDNO.1)的BacillussubtilisWB600细胞以5％的接种量，接入5LTB培养基，温度30℃，搅拌桨转速150rpm，培养36h；发酵液上清TrSOX活性达到1200U/mL；2)将上述5L含有1200U/mLTrSOX的发酵上清液与5L20％含量的N-甲基-DL-天冬氨酸溶液混合，搅拌桨转速150rpm，pH值维持在6，反应温度维持在40℃，反应12h，利用HPLC与TLC检测N-甲基-L-天冬氨酸与L-天冬氨酸的含量，N-甲基-L-天冬氨酸的脱甲基转化率达到约48％。3)酶转化结束后，加入0.2％(质量体积比)的明矾在40℃絮凝2h，板框过滤去除絮凝物。使用浓硫酸将溶液pH值调节至2，析出N-甲基-D-天冬氨酸晶体，进行一次重结晶，得到光学纯度接近70％的目标产物，产物回收率约40％。实施例2：一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：1)将转化入pMA5-YwbN-trsox质粒(SEQIDNO.1)的BacillussubtilisWB600细胞以5％的接种量，接入5LTB培养基，温度40℃，搅拌桨转速150rpm，培养36h；发酵液上清TrSOX活性达到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶法拆分制备N‑甲基‑D‑天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶基因构建于pMA5‑YwbN‑trsox质粒，并转化Bacillus subtilis WB600细胞中进行分泌性表达；(2)将转入pMA5‑YwbN‑trsox基因质粒的Bacillus subtilis WB600细胞进行发酵，获得的培养液上清与N‑甲基‑DL‑天冬氨酸溶液混合，针对N‑甲基‑L‑天冬氨酸进行具有手性选择性的生物催化；(3)采用等电点结晶法分离得到N‑甲基‑D天冬氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将Thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶基因构建于pMA5-YwbN-trsox质粒，并转化BacillussubtilisWB600细胞中进行分泌性表达；(2)将转入pMA5-YwbN-trsox基因质粒的BacillussubtilisWB600细胞进行发酵，获得的培养液上清与N-甲基-DL-天冬氨酸溶液混合，针对N-甲基-L-天冬氨酸进行具有手性选择性的生物催化；(3)采用等电点结晶法分离得到N-甲基-D天冬氨酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pMA5-YwbN-trsox质粒质粒的基因序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛瑜，张梁，张瑶，高秋月，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32