一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法技术

本发明专利技术提供了一种L‑天冬氨酸的酶法转化制备方法，步骤如下：将具有天冬氨酸酶活性的菌株于培养基中发酵培养，得含天冬氨酸酶的湿菌体；将湿菌体加入固定化混合物中，混合后滴加到氯化钙溶液中，形成固定化细胞；其中，固定化混合物包括纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛；将固定化细胞加入转化液中进行酶促反应，再通过等电点结晶法分离得L‑天冬氨酸。本发明专利技术采用L‑天冬氨酸的特定菌株，在发酵培养基中培养以高效表达L‑天冬氨酸酶，并利用纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛作为固定化混合物来固定化天冬氨酸酶，使酶法合成L‑天冬氨酸具有较高的催化速率和转化率；此外，酶法合成反应还具有条件温和、酶立体选择性强的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法
本专利技术涉及L-天冬氨酸的制备领域，尤其涉及一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法。
技术介绍
L-天冬氨酸是一种重要的酸性氨基酸，具有改善心肌功能的生理功能。L-天冬氨酸可用于医药领域，具有非常广泛的应用前景。天冬氨酸酶(E.C.4.3.1.1)是一种重要的工业用酶，大肠杆菌的天冬氨酸酶由四个相同亚基构成，每个亚基由477个氨基酸残基组成。目前为止，以富马酸和氨为原料，并通过固定化L-天冬氨酸酶催化生产L-天冬氨酸的报道很多，但却尚未有利用纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛固定化天冬氨酸酶以进一步制备得到L-天冬氨酸的报道。据此，目前急需一种利用纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛作为固定化混合物以固定化天冬氨酸酶，从而进一步制备L-天冬氨酸的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种利用纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛作为固定化混合物的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法。本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：(1)将具有天冬氨酸酶活性的菌株于培养基中发酵培养，发酵液离心后，得含天冬氨酸酶的湿菌体；(2)将上述含天冬氨酸酶的湿菌体加入到固定化混合物中混合；混合后，滴加到氯化钙溶液中，形成固定化细胞；其中，固定化混合物包括：纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛；(3)将上述固定化细胞加入转化液中，在35-50℃，pH6-11的条件下进行酶促反应，再通过等电点结晶法分离得到L-天冬氨酸；其中，转化液包括富马酸和氨，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇中的一种。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中具有天冬氨酸酶活性的菌株选自大肠杆菌ATCC15489、枯草芽孢杆菌CGMCCNO:1.1628、施氏假单胞菌CGMCCNO:1.202、铜绿假单胞菌CGMCCNO：1.1129中的一种。作为本专利技术的优选方式之一，所述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌、铜绿假单胞菌均直接购自国内外市场。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中培养基成分包括：10-45g/L碳源物质、5-45g/L氮源物质、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/LK2HPO4、1.0g/LMgSO4、0.06g/LCaCl2、0.002g/LCoCl2、0.0001g/LMnC4H6O4·4H2O。作为本专利技术的优选方式之一，所述碳源物质采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖中的一种或多种。作为本专利技术的优选方式之一，所述氮源物质采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼水解液、花生饼粉、黄豆饼粉中的一种或多种。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛的具体浓度为：纳米二氧化硅0.05-0.1g/L、海藻酸钠10-30g/L、戊二醛5-10g/L。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中富马酸的浓度为50-350g/L。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中氨的浓度为5-60g/L。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇的浓度为0.001g/L-5.0g/L。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中通过等电点结晶法分离得到L-天冬氨酸的具体步骤为：将酶促反应后的转化液于4000-6000r/min转速下离心15-20min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH2-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品。本专利技术相比现有技术的优点在于：本专利技术采用L-天冬氨酸的特定菌株在发酵培养基中培养，高效表达L-天冬氨酸酶；接着，利用纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛作为固定化混合物以固定化天冬氨酸酶，并进一步酶法合成L-天冬氨酸，具有较高的催化速率和转化率，其中的富马酸摩尔转化率更是达到99％以上；另外，酶法合成L-天冬氨酸还具有反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，成本低，工艺流程简单等优点，适合工业化生产。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1本实施例的一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：(1)将1000mL大肠杆菌ATCC15489在培养基(10g/L葡萄糖、5g/L牛肉膏、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/LK2HPO4、1.0g/LMgSO4、0.06g/LCaCl2、0.002g/LCoCl2、0.0001g/LMnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到15g湿菌体；(2)将上述湿菌体加入到固定化混合物(含0.05g/L纳米二氧化硅、10g/L海藻酸钠、5g/L戊二醛)中混合，混合后，滴加到氯化钙溶液中形成固定化细胞；(3)将上述固定化细胞加入到500mL转化液(含50g/L富马酸、5g/L氨和0.001g/L乙酸乙酯)中，在pH6，35℃的条件下酶促反应12h，反应结束后，L-天冬氨酸摩尔转化率为99％；(4)将酶促反应后的转化液于4000r/min转速下离心15min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH2，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品，纯度为99.9％。实施例2本实施例的一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：(1)将1000mL大肠杆菌ATCC15489在培养基(45g/L麦芽糖、45g/L酵母膏、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/LK2HPO4、1.0g/LMgSO4、0.06g/LCaCl2、0.002g/LCoCl2、0.0001g/LMnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到14g湿菌体；(2)将上述湿菌体加入到固定化混合物(含0.1g/L纳米二氧化硅、30g/L海藻酸钠、10g/L戊二醛)中混合，混合后，滴加到氯化钙溶液中形成固定化细胞；(3)将上述固定化细胞加入到500mL转化液(含350g/L富马酸、60g/L氨和5.0g/L乙酸乙酯)中，在pH11，50℃的条件下酶促反应12h，反应结束后，L-天冬氨酸摩尔转化率为99％；(4)将酶促反应后的转化液于6000r/min转速下离心20min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品，纯度为99.9％。实施例3本实施例的一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：(1)将1000mL大肠杆菌ATCC15489在培养基(30g/L蔗糖、30g/L玉米浆、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/LK2HPO4、1.0g/LMgSO4、0.06g/LCaCl2、0.002g/LCoCl2、0.0001g/LMnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到14g湿菌体；(2)将上述湿菌体加入到固定化混合物(含0.1g/L纳米二氧化硅、30g/L海藻酸钠、10g/L戊二醛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L‑天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将具有天冬氨酸酶活性的菌株于培养基中发酵培养，发酵液离心后，得含天冬氨酸酶的湿菌体；(2)将上述含天冬氨酸酶的湿菌体加入到固定化混合物中混合；混合后，滴加到氯化钙溶液中，形成固定化细胞；其中，固定化混合物包括：纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛；(3)将上述固定化细胞加入转化液中，在35‑50℃，pH 6‑11的条件下进行酶促反应，再通过等电点结晶法分离得到L‑天冬氨酸；其中，转化液包括富马酸和氨，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇中的一种。

【技术特征摘要】
1.一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将具有天冬氨酸酶活性的菌株于培养基中发酵培养，发酵液离心后，得含天冬氨酸酶的湿菌体；(2)将上述含天冬氨酸酶的湿菌体加入到固定化混合物中混合；混合后，滴加到氯化钙溶液中，形成固定化细胞；其中，固定化混合物包括：纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛；(3)将上述固定化细胞加入转化液中，在35-50℃，pH6-11的条件下进行酶促反应，再通过等电点结晶法分离得到L-天冬氨酸；其中，转化液包括富马酸和氨，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇中的一种。2.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中具有天冬氨酸酶活性的菌株选自大肠杆菌ATCC15489、枯草芽孢杆菌CGMCCNO:1.1628、施氏假单胞菌CGMCCNO:1.202、铜绿假单胞菌CGMCCNO：1.1129中的一种。3.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养基成分包括：10-45g/L碳源物质、5-45g/L氮源物质、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/LK2HPO4、1.0g/LMgSO4、0.06g/LCaCl2、0.002g/LCoCl2、0.0001g/LMnC4H6O4·4H2O。4.根据权利要求3所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述碳...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐礼生，
申请(专利权)人：宿州学院，
类型：发明
国别省市：安徽,34