利用CRISPR/Cas9技术对葡萄ZEP基因定点编辑方法技术

利用CRISPR/Cas9技术对葡萄ZEP基因定点编辑方法。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术，针对葡萄ZEP基因，通过筛选、设计sgRNA，进一步构建重组质粒，以含有该重组质粒的农杆菌侵染葡萄无菌苗子叶胚，筛选后获得突变的转基因葡萄植株。本发明专利技术精准定位选择葡萄ZEP基因的第一个外显子上的序列作为靶位点序列，该段序列能够成功被Cas9识别，以该靶位点序列为基础设计sgRNA，靶位点序列可被准确敲除，脱靶效率低，实现对葡萄ZEP基因进行定点编辑，对葡萄育种具有重要作用。

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9技术对葡萄ZEP基因定点编辑方法
本专利技术涉及植物基因工程技术，尤其是涉及葡萄ZEP基因定点编辑方法。
技术介绍
近几年来，CRISPR/Cas9基因组编辑技术发展迅速，已逐步成为生物学研究领域的前沿和热点。该技术通过对基因组位点的精确编辑，实现靶DNA片段的敲除或插入，继而改变基因性状，为分子育种开辟新的研究思路。截至目前，基于CRISPR/Cas9技术的分子育种研究已先后在水稻、油菜、番茄等植物上开展，且取得良好效应。Li等人将MYB25基因的两个sgRNA：GhMYB25-like-sgRNA1和GhMYB25-like-sgRNA2设计在一个相同的基因组区，分别诱导两个Cas9，从而高效率的敲除棉花的MYB25基因，得到了两个靶标位点的碱基以及其中间的染色体片缺失的结果，脱靶效率也极低。Ren等人利用CRISPR/Cas9系统对“霞多丽”葡萄的悬浮细胞及愈伤组织中的L-二酸脱氢酶基因(IdnDH)进行基因组编辑和靶向突变，突变频率为100％，并且得到了突变体的再生植株。葡萄作为重要的果树植物之一，借助基因组编辑开展新品种选育具有重要的应用价值。目前对葡萄ZEP基因进行编辑还未见报道。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术利用CRISPR/Cas9技术，针对葡萄ZEP基因，通过筛选、设计sgRNA，进一步构建重组质粒，以含有该重组质粒的农杆菌侵染葡萄无菌苗子叶胚筛选后获得突变的转基因葡萄植株。本专利技术的技术方案是提供一种利用CRISPR/Cas9技术对葡萄ZEP基因定点编辑方法，其中，sgRNA包括ZEP-gRNA1和ZEP-gRNA2，ZEP-gRNA1序列如SEQIDNO:1所示，ZEP-gRNA2序列如SEQIDNO:2所示。ZEP-gRNA1的引物序列如下ZEP-gRNA1-F(SEQIDNO:3):TAGGTCTCCCACACCAGCGCCGCGTTTTAGAGCTAG；ZEP-gRNA1-R(SEQIDNO:4):CGGGTCTCATGTGGCTTCATGCACCAGCCGGG；ZEP-gRNA2的引物序列如下ZEP-gRNA2-F(SEQIDNO:5):TAGGTCTCCGTGACCGGATTAATGTTTTAGAGCTAG；ZEP-gRNA2-R(SEQIDNO:6):CGGGTCTCATCACCAGTGATGCACCAGCCGGG。将两个sgRNA通过PCR重组到一起，并与载体片段pGREBn进行连接，构建得到含有葡萄ZEP基因靶序列的质粒pGREBn-ZEP；用含有pGREBn-ZEP质粒的农杆菌GV3101侵染葡萄无菌苗子叶胚，通过卡那霉素进行筛选，再获得突变的转基因葡萄植株；最后利用葡萄ZEP基因的特异性引物，ZEP1-F(SEQIDNO:7)：TTCTCAGACCCACATCCCAA；ZEP1-R(SEQIDNO:8)：ACCTCCTCAGCAACCTCCAT；ZEP2-F(SEQIDNO:9)：GGCAGCGAAGAAGAAGGGTT；ZEP2-R(SEQIDNO:10):CCGCAGGAGTGAATGTATCA扩增基因组片段进行预测，筛选突变植株。本专利技术的优点和有益效果：精准定位选择葡萄ZEP基因的第一个外显子上的序列作为靶位点序列，该段序列能够成功被Cas9识别，以该靶位点序列为基础设计sgRNA，靶位点序列可被准确敲除，脱靶效率低，实现对葡萄ZEP基因进行定点编辑，对葡萄育种具有重要作用。附图说明图1是本专利技术两个sgRNA的PCR扩增电泳图。图2是对转化菌株中重组质粒的目标条带进行检测的电泳图。图3是农杆菌转化葡萄无菌苗子叶胚后培养所得的突变体新芽照片。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步说明。本专利技术提供一种利用CRISPR/Cas9技术对葡萄ZEP基因定点编辑方法，包括筛选设计sgRNA，将sgRNA连接到载体质粒上，将重组质粒转化入农杆菌活化农杆菌后进行培养，通过培养所得的菌株侵染葡萄无菌苗子叶胚，培养侵染的葡萄无菌苗子叶胚得到植株。现有技术中没有关于葡萄ZEP基因编辑的公开文献，CRISPR/Cas9基因定点编辑这一技术的难点在于找到基因序列中可被Cas9识别的序列，同时该序列易于进行敲除或者加入的编辑过程，准确率和脱靶效率必须良好，易于顺利进行重组克隆。申请人发现葡萄ZEP基因的第一个外显子上，PAM序列的前20nt序列片段即具备上述特点，不但可被Cas9识别，而且脱靶效率低，能够成功得到突变葡萄植株，因此上述序列片段适宜作为靶位点序列，并结合脱靶效率和编辑效率，设计了ZEP-gRNA1和ZEP-gRNA2。以下以具体操作过程对本专利技术进行详细说明，本专利技术项目基础为浙江省“生物工程”重中之重学科学生创新计划项目(CX2017011)。实施例1结合葡萄全基因组测序结果，对从“夏黑”葡萄中克隆得到的VvZEP基因做结构分析，发现其第一个外显子能够作为靶位点。随后利用在线设计工具CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)在ZEP基因的第一个外显子中设计两个sgRNA，分别为ZEP-gRNA1和ZEP-gRNA2，ZEP-gRNA1序列为SEQIDNO:1：TGAAGCCACACCAGCGCCGC或TGAAGCCACACCAGCGCCGG，ZEP-gRNA2序列为SEQIDNO:2：TCACTGGTGACCGGATTAAT或TCACTGGTGACCGGATTGGG。以pGTR为模板，分别扩增ZEP-gRNA1和ZEP-gRNA2。其中ZEP-gRNA1的上下游引物为ZEP-gRNA1-F(SEQIDNO:3)和ZEP-gRNA1-R(SEQIDNO:4)，ZEP-gRNA2的上下游引物为ZEP-gRNA2-F(SEQIDNO:5)和ZEP-gRNA2-R(SEQIDNO:6)扩增体系为模板1ng，上下游引物各2μL，2×EsTaqMasterMix25μL，ddH2O加至50μL。PCR条件为60℃，34个循环，其他与普通PCR条件相同。将PCR进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，100V电泳30min后，检测条带的大小和完整性，如图1所示，结果显示所得序列大小正确，为目的序列。并在紫外分析仪上进行割胶，将切下的凝胶放在离心管中称重，并用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行胶回收。分别用BsaI酶、T7DNA连接酶对两个sgRNA进行酶切连接，产物以S5AD5-F、S3AD5-R(S5AD5-F、S3AD5-R参见BoostingCRISPR/Cas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem，XieK,MinkenbergB,YangY，ProcNatlAcadSciUSA，2015，vol.112，no.11，P3570-3575)为引物做PCR，循环条件：94℃，2min；(94℃,30s；60℃，30s；72℃,30s)34个循环，72℃，5min。利用PCR产物纯化试剂盒进行PCR产物纯化回收。上述PCR产物用FokI酶切，得酶切产物i。取2-3μgpRGEBn载体，加入1μL的BsaI酶以及10×C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于葡萄ZEP基因定点编辑的sgRNA，其特征在于，包括ZEP‑gRNA1和ZEP‑gRNA2，所述ZEP‑gRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，所述ZEP‑gRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.用于葡萄ZEP基因定点编辑的sgRNA，其特征在于，包括ZEP-gRNA1和ZEP-gRNA2，所述ZEP-gRNA1序列如SEQIDNO:1所示，所述ZEP-gRNA2序列如SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的用于葡萄ZEP基因定点编辑的sgRNA，其特征在于，所述ZEP-gRNA1的上游引物为ZEP-gRNA1-F，序列如SEQIDNO:3所示，下游引物为ZEP-gRNA1-R，序列如SEQIDNO:4所示；所述ZEP-gRNA2的上游引物为ZEP-gRNA2-F，序列如SEQIDNO:5所示，下游引物为ZEP-gRNA2-R，序列如SEQIDNO:6所示。3.用于筛选葡萄ZEP基因定点编辑突变体的特异性引物，其特征在于，共有两对引物，分别为ZEP1-F、ZEP1-R和ZEP2-F、ZEP2-R，所示ZEP1-F序列如SEQIDNO:7所示，所述ZEP1-R序列如SEQIDNO:8所示，所述ZEP2-F序列如SEQIDNO:9所示，所述ZEP2-R序列如SEQIDNO:10所示。4.用于葡萄ZEP基因定点编辑的重组载体pGREBn-ZEP，其特征在于，为ZEP-gRNA1和ZEP-gRNA2酶切连接后与载体pGREBn连接而得。5.利用CRISPR/Cas9技术对葡萄ZEP基因定点编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选择葡萄ZEP基因第一个外显子上的PAM序列的前20nt序列片段作为靶位点，设计如权利要求1所述的ZEP-gRNA1和ZEP-gRNA2；(2)利用两对如权利要求2所述的上游引物和下游引物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴月燕，邱甜，贾永红，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33