一种选育广谱抗马铃薯Y病毒属病毒的烟草植物的方法技术

本发明专利技术涉及一种选育广谱抗马铃薯Y病毒属病毒(Potyviruses)的烟草植物的方法，在烟草植物中聚合eIFiso4E‑S基因突变体、eIFiso4E‑T基因突变体和eIF14E1基因突变体，可获得烟草对至少4种Potyviruses的抗性，包括马铃薯Y病毒(PVY)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)。本发明专利技术所述方法对于培育抗Potyviruses烟草具有重大应用前景。

A Method for Breeding Tobacco Plants with Broad-spectrum Resistance to Potato Y Virus

The present invention relates to a method for breeding tobacco plants with broad-spectrum resistance to Potyviruses. By aggregating eIFiso4E_S gene mutants, eIFiso4E_T gene mutants and eIF14E1 gene mutants in tobacco plants, tobacco resistance to at least four kinds of Potyviruses can be obtained, including potato Y virus (PVY), chili vein mottle virus (ChiVMV) and tobacco vein mosaic virus (T). VBMV). The method has great application prospect for cultivating anti-Potyviruses tobacco.

【技术实现步骤摘要】
一种选育广谱抗马铃薯Y病毒属病毒的烟草植物的方法
本专利技术属于生物
，进一步属于烟草生物技术育种领域，具体涉及一种聚合eIFiso4E-S基因突变体、eIFiso4E-T基因突变体和eIF4E1基因突变体，获得广谱抗马铃薯Y病毒属病毒的烟草植物的方法。
技术介绍
马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒包括10个以上成员，主要危害茄科(Solanaceae)作物。Potyviruses主要危害烟草、番茄和辣椒等茄科作物，近年来于马铃薯Y病毒(PVY)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)已经上升为烟草上的常见病害。在同科作物相邻种植的农田生态下，控制一种作物上Potyviruses的发生不仅有利于该作物的病害防治，也有利于其他作物的病害治理。Potyviruses在田间由蚜虫非持久性传播。由于蚜虫发育周期短、繁殖力强和易产生抗药性，利用化学药剂防治媒介昆虫来治理该病害效果有限，因此，选育Potyviruses抗病品种依然是防控Potyviruses最根本、最经济有效的手段。烟草作为重要的经济作物和植物研究重要的模式作物，有关抗马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)资源鉴定、抗病育种和病原调查鉴定研究较多。其中通过X-射线诱变获得的va基因抗病资源，已广泛应用于选育烟草抗PVY品种。烟草eIF4E1基因(有的文献缩写为eIF4E-1，GenBank序列登录号KF155696)缺失或突变导致烟草产生针对PVY的抗性(刘勇等，2013；Julio等，2014)，eIF4E1多肽能和PVY的VPg蛋白互作从而起始病毒功能蛋白的翻译，是PVY侵染植物必需的植物寄主因子。烟草上未见兼抗马铃薯Y病毒(PVY)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)的报道。本专利技术申请人提出如下假说：在缺失eIF4E1基因的普通烟草(va)中，Potyviruses与烟草eIF4E家族某些成员互作，完成侵染循环，同时敲除eIF4E1和两个成员有望获得Potyviruses抗性的育种材料。本专利技术通过聚合eifiso4e-sKO突变体、eifiso4e-tKO突变体和eif4e1突变体，获得兼抗PVYWT、PVYvaB、ChiVMV和TVBMV基因资源和抗病材料。对茄科作物烟草、马铃薯、辣椒、番茄抗Potyviruses育种具有重要的借鉴作用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种获得对马铃薯Y病毒属病毒抗性的烟草植物的方法。本专利技术目的通过以下四个步骤实现：A步骤：通过基因编辑、物理诱变、化学诱变、种质资源筛选、基因人工合成、基因表达干涉等方法，获得eIFiso4E-S敲除(eifiso4e-sKO)的材料。B步骤：通过基因编辑、物理诱变、化学诱变、种质资源筛选、基因人工合成、基因表达干涉等方法，获得eIFiso4E-T敲除(eifiso4e-tKO)的材料。C步骤：通过基因编辑、物理诱变、化学诱变、种质资源筛选、基因人工合成、基因表达干涉等方法，获得eIF4E1敲除(eif14e1KO)的材料。D步骤：将上述A、B和C步骤获得的材料聚合，获得eIFiso4E-S敲除(eifiso4e-sKO)、eIFiso4E-T敲除(eifiso4e-tKO)与eIF4E1敲除(eif14e1KO)的聚合的各种组合。优选的应用途径为：(1)在上述A步骤获得的材料的基础上，获得上述B步骤的目标材料；或者在上述B步骤获得的材料的基础上，获得上述A步骤的目标材料。(2)分别获得上述A步骤的目标材料、B步骤的目标材料，然后利用杂交育种、体细胞杂交等方式聚合，获得eIFiso4E-S敲除(eifiso4e-sKO)与eIF4E1敲除(eif14e1KO)的聚合的各种组合。进一步优选的应用途径为：(1)在eIF4E1敲除(eif4e1KO)的基础上，通过基因编辑、化学诱变、物理诱变得到含eifiso4e-sKO/eif4e1KO基因的烟草植株，在eifiso4e-sKO/eif4e1KO基础上进一步获得eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/eif4e1KO基因的烟草植株。(2)从烟草属植物中分别筛选获得包含eifiso4e-sKO、eifiso4e-tKO和eif4E1KO基因的种质资源；所述的种质资源包含烟草野生种、栽培种、以及野生种与栽培种的杂交种。然后，通过杂交、回交等育种手段，获得含eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/eif4e1KO基因的烟草植株。更进一步优选的应用途径为：(1)在eIF4E1敲除(eif4e1KO)的基础上，通过设计同时靶向eIFiso4E-S和eIFiso4E-TKO的基因编辑载体，通过筛选双基因突变体，获得eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/eif4e1KO基因的烟草植株。根据所述获得对马铃薯Y病毒属病毒抗性的烟草植株的方法，可以得到新的抗Potyviruses烟草品种、及其种子和无性繁殖体。另外，还可以开发一些基因工程产品，包括A:所述eIFiso4E-S基因Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。B:所述eIFiso4E-S基因Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。C:包括所述eIF4E1基因Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。D:所述eIFiso4E-S基因、eIFiso4E-T基因和eIFiso4E1基因两两或三个同时Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。利用上述基因工程产品使烟草获得对Potyviruses的抗性。定义：基因敲除：geneknockout(简写:KO)，指利用遗传操作技术使生物体的一个或多个基因失去功能。基因敲除的方法有同源重组(homologousrecombination)和位点特异性核酸酶技术(site-specificnucleases)。位点特异性核酸酶技术包括锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs))。规律成簇的间隔短回文重复核酸酶技术(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)。基因敲除可产生基因失去功能突变体(Loss-of-function,LOS)。染色体片段导入：通常通过系统回交和自交，并借助于分子标记辅助选择使供体亲本的片段导入到轮回亲本中。基因导入是将外源基因导入目的烟草中，包括将外源基因转入后导入(即转基因)和直接导入，转基因最常用的方法为农杆菌转化法；直接导入的方法包括显微注射、花粉管通道法、电导、基因枪等常规生物学方法转化烟草细胞或组织，并将转化的组织培育成植株。基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删除等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。基因编辑最常用的方法括锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶、规律成簇的间隔短回文重复核酸酶技术。基因沉默(genesilencing)：外源基因存在于生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种选育广谱抗马铃薯Y病毒属病毒的烟草植物的方法，其特征在于，所述方法向烟草基因组引入至少3种真核生物翻译起始因子(eIF4E)家族基因中各至少一种等位基因内的突变，所述突变降低真核生物翻译起始因子的表达或功能，且其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第一种基因编码eIFiso4E‑S多肽，其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第二种基因编码eIFiso4E‑T多肽，其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第三种基因编码eIF4E1多肽，其中：a)所述eIFiso4E‑S基因的所述突变导致所述eIFiso4E‑S多肽翻译提前终止或阅读框移码或氨基酸转换，所述eIFiso4E‑S基因突变发生于编码SEQ ID NO:2多肽的外显子区域；或者b)所述eIFiso4E‑T基因的所述突变导致所述eIFiso4E‑T多肽翻译提前终止或阅读框移码或氨基酸转换，所述eIFiso4E‑T基因突变发生于编码SEQ ID NO:4多肽的外显子区域；或者c)所述eIF4E1基因的所述突变导致所述eIF4E1多肽缺失，所述突变导致包含SEQ ID NO:5核苷酸的序列缺失。

【技术特征摘要】
1.一种选育广谱抗马铃薯Y病毒属病毒的烟草植物的方法，其特征在于，所述方法向烟草基因组引入至少3种真核生物翻译起始因子(eIF4E)家族基因中各至少一种等位基因内的突变，所述突变降低真核生物翻译起始因子的表达或功能，且其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第一种基因编码eIFiso4E-S多肽，其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第二种基因编码eIFiso4E-T多肽，其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第三种基因编码eIF4E1多肽，其中：a)所述eIFiso4E-S基因的所述突变导致所述eIFiso4E-S多肽翻译提前终止或阅读框移码或氨基酸转换，所述eIFiso4E-S基因突变发生于编码SEQIDNO:2多肽的外显子区域；或者b)所述eIFiso4E-T基因的所述突变导致所述eIFiso4E-T多肽翻译提前终止或阅读框移码或氨基酸转换，所述eIFiso4E-T基因突变发生于编码SEQIDNO:4多肽的外显子区域；或者c)所述eIF4E1基因的所述突变导致所述eIF4E1多肽缺失，所述突变导致包含SEQIDNO:5核苷酸的序列缺失。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述eIFiso4E-S基因突变发生于SEQIDNO:1所示区域，所述编号的依据是SEQIDNO:1，选自以下组：a)第11至第18位核苷酸缺失；第11至第17位核苷酸缺失；(2-1398g1-2B,)；第11位增加一个A(2-1398g1-2G)b)在靶位点增加1-n个碱基、删除1-n个碱基，n为2至10的整数；c)碱基替换导致氨基酸转换；d)其任意组合。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述eIFiso4E-T基因突变发生于SEQIDNO:3所示区域，所述编号的依据是SEQIDNO:3，选自以下组：a)第11-12位核苷酸缺失；(2-1398g1-2B,)第11位核苷酸缺失；第11-15位核苷酸缺失(2-1398g1-2G,)b)在靶位点增加1-n个碱基、删除1-n个碱基，n为2至10的整数；c)碱基替换导致氨基酸转换；d)其任意组合。4.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，黄昌军，于海芹，曾建敏，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53