抗人EGFR的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗人EGFR的纳米抗体及其应用。该纳米抗体是氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的aEG1B4纳米抗体、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的aEG2C7纳米抗体、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的aEG2E12纳米抗体、氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的aEG4D9纳米抗体氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的aEG6B2纳米抗体中的一种或至少两种组合形成的抗体。该纳米抗体具有高度亲和力、特异性和低免疫原性，并且具有较好的稳定性，结构简单，易于进行工程化改造等优点，可更好地应用于抗体药物的开发。

【技术实现步骤摘要】
抗人EGFR的纳米抗体及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种抗人EGFR的纳米抗体及其应用。
技术介绍
癌症这一名词在公元前400多年就被提出，经过2000多年依然没有被攻克，如今对人类健康的威胁愈加明显。近年来，研究发现表皮生长因子(EGFR)在多种实体瘤细胞中过表达，并且在癌症的发生、发展过程中发挥重要的作用，与预后差和耐药性正相关。EGFR在癌细胞中过表达可导致EGFR/EGF信号通路的持续性激活，促进癌细胞的增殖、迁移及侵袭活动，并且还可以促进VEGF因子的分泌，导致癌组织微环境血管形成。目前，靶向EGFR的抗体在非小细胞肺癌的临床治疗取得了较好的效果，但由于是嵌合型抗体，所以存在一定的免疫源性，并且由于其分子量大渗透能力差，不能有效清除微小病灶。纳米抗体(Nanobody，Nb)是一种只含有单个结构域的基因工程抗体，能够以高亲和力和特异性与抗原结合。纳米抗体由于抗体分子量小，便于在大肠杆菌中表达，大大降低了抗体生产的成本。同时，抗体结构简单，利于对其进一步改造。纳米抗体分子体积较小的特点也提高了抗体在疗中过程中的组织渗透能力。因此，抗EGFR的纳米抗体在EGFR靶向的癌症治疗中，具有很高的医学应用价值。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗人EGFR的纳米抗体。本专利技术的另一目的在于提供上述抗人EGFR的纳米抗体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种抗人EGFR的纳米抗体，为名称为aEG1B4纳米抗体、aEG2C7纳米抗体、aEG2E12纳米抗体、aEG4D9纳米抗体和aEG6B2纳米抗体中的一种或至少两种组合形成的抗体；所述的aEG1B4纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；所述的aEG2C7纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；所述的aEG2E12纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；所述的aEG4D9纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；所述的aEG6B2纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。编码上述抗人EGFR的纳米抗体的核苷酸序列，是编码所述的aEG1B4纳米抗体的核苷酸序列、编码所述的aEG2C7纳米抗体的核苷酸序列、编码所述的aEG2E12纳米抗体的核苷酸序列、编码所述的aEG4D9纳米抗体的核苷酸序列和编码所述的aEG6B2纳米抗体的核苷酸序列中的一种或至少两种组合形成的核苷酸序列。编码所述的aEG1B4纳米抗体的核苷酸序列优选如SEQIDNO:8所示。编码所述的aEG2C7纳米抗体的核苷酸序列优选如SEQIDNO:9所示。编码所述的aEG2E12纳米抗体的核苷酸序列优选如SEQIDNO:10所示。编码所述的aEG4D9纳米抗体的核苷酸序列优选如SEQIDNO:11所示。编码所述的aEG6B2纳米抗体的核苷酸序列优选如SEQIDNO:12所示。编码所述的aEG1B4纳米抗体、aEG2C7纳米抗体、aEG2E12纳米抗体、aEG4D9纳米抗体和aEG6B2纳米抗体的核苷酸序列分别由375、393、375、381和372个碱基组成，对应编码的氨基酸分别为125、131、125、127和124个。aEG1B4抗体含有3个互补决定簇(CDR)，其中，编码CDR1的氨基酸为VNVSNEVMS，编码CDR2的氨基酸为TIANHS，编码CDR3的氨基酸为TLYSGATKQLEY。aEG2C7抗体含有3个互补决定簇，其中，编码CDR1的氨基酸为FTFNNEIMA，编码CDR2的氨基酸为SIAANN，编码CDR3的氨基酸为RYAAEPHTYSMGNKSLRY。aEG2E12抗体含有3个互补决定簇，其中，编码CDR1的氨基酸为YSSNNEFMA，编码CDR2的氨基酸为AISTRN，编码CDR3的氨基酸为GVSYRRPQQLKY。aEG4D9抗体含有3个互补决定簇，其中，编码CDR1的氨基酸为DMLSPDNMT，编码CDR2的氨基酸为TIHKTD，编码CDR3的氨基酸为GLRSRGLSSKYLEY。aEG6B2抗体含有3个CDR，其中，编码CDR1的氨基酸为FNVNPKYMT，编码CDR2的氨基酸为SIRSPG，编码CDR3的氨基酸为SVSRDEKYMRF。所述的抗人EGFR的纳米抗体含有相同的骨架区：编码FR1的氨基酸为MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG，编码FR2的氨基酸为WVRQAPGKGLEWVS，编码FR3的氨基酸为GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA，编码FR4的氨基酸为WGQGTLVTVSSAAA。所述的抗人EGFR的纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：通过基因(DNA)合成的方法合成编码所述抗人EGFR的纳米抗体的核苷酸，然后将其克隆到表达质粒载体上，转化至宿主细胞中进行表达、纯化，得到抗人EGFR的纳米抗体；也可以通过多肽合成的方法，直接合成得到抗人EGFR的纳米抗体。所述的抗人EGFR的纳米抗体在制备治疗EGFR过表达为特征疾病的抗体药物中的应用。所述的EGFR过表达为特征的疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。所述的癌症为EGFR高表达肿瘤。所述的EGFR高表达肿瘤具体可为肺癌、头颈癌、结肠癌及脑肿瘤。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1.本专利技术通过噬菌体展示的方法在人源纳米抗体文库中筛选出的与EGFR胞外部分结构域(domain)III相互作用的纳米抗体可在无需使用抗原免疫人体的情况下获得全人源单克隆纳米抗体，其分子量约为13kDa，只含有单个结构域，具有高度亲和力、特异性和低度致人免疫性，并且，结合蛋白高表达的原核宿主进行抗体表达，能显著降低抗体的生产成本，促进抗体的应用。2.本专利技术提供的纳米抗体，具有稳定性好、易于改造，具有较好的组织渗透能力等优点。3.本专利技术提供的纳米抗体是人源的，因而在人体无免疫原性，可更好地应用于抗肿瘤抗体药物的开发。4.本专利技术提供的纳米抗体结合蛋白高表达的原核宿主进行抗体表达，能显著降低抗体的生产成本，促进抗体的应用。附图说明图1为多克隆ELISA分析纳米抗体库的筛选富集结果图；其中，PBS孔为空白对照，EGFR孔包被了合成的EGFR多肽；一抗为各轮库筛选后扩增纯化获得的多克隆噬菌体抗体，二抗为HRP标记的抗噬菌体M13的抗体。图2为单克隆噬菌体ELISA筛选与EGFR多肽结合的阳性克隆结果图；其中，每个单克隆包括：PBS(空白对照孔)，CXCR4多肽(无关抗原对照孔)，EGFR多肽(目的抗原孔)。图3为抗体蛋白表达纯化后SDS-PAGE蛋白电泳图；其中，图A是aEG1B4的电泳图，图B是aEG2C7的电泳图，图C是aEG2E12的电泳图，图D是aEG4D9的电泳图，图E是aEG6B2，图A-E中：泳道1是Marker，泳道2是未诱导的全蛋白，泳道3是诱导的全蛋白，泳道4是诱导的破碎沉淀，泳道5是诱导的破碎上清，泳道6是过柱液蛋白，泳道7是洗杂液蛋白，泳道8-12均为洗脱蛋白管。图4为采用ELISA方法检测纯化的抗EGFR纳米抗体与EGFR多肽的结合情况图；其中，每个抗体包括空白对照孔PBS，7个无关抗原对照孔：VEGF、CAMPH、BMP2、ENDOF1、FGF21、HER2和CX本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗人EGFR的纳米抗体，其特征在于：所述的抗人EGFR的纳米抗体是名称为aEG1B4纳米抗体、aEG2C7纳米抗体、aEG2E12纳米抗体、aEG4D9纳米抗体和aEG6B2纳米抗体中的一种或至少两种组合形成的抗体；所述的aEG1B4纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的aEG2C7纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的aEG2E12纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述的aEG4D9纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述的aEG6B2纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗人EGFR的纳米抗体，其特征在于：所述的抗人EGFR的纳米抗体是名称为aEG1B4纳米抗体、aEG2C7纳米抗体、aEG2E12纳米抗体、aEG4D9纳米抗体和aEG6B2纳米抗体中的一种或至少两种组合形成的抗体；所述的aEG1B4纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；所述的aEG2C7纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；所述的aEG2E12纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；所述的aEG4D9纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；所述的aEG6B2纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。2.权利要求1所述的抗人EGFR的纳米抗体的编码核苷酸序列，其特征在于：是编码所述的aEG1B4纳米抗体的核苷酸序列、编码所述的aEG2C7纳米抗体的核苷酸序列、编码所述的aEG2E12纳米抗体的核苷酸序列、编码所述的aEG4D9纳米抗体的核苷酸序列和编码所述的aEG6B2纳米抗体的核苷酸序列中的一种或至少两种组合形成的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的抗人EGFR的纳米抗体的编码核苷酸序列，其特征在于：编码所述的aEG1B4纳米抗体的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示；编码所述的aEG2C7纳米抗体的核苷酸序列如SEQIDNO:9所...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏星，刘雪，陈涛，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44