一种包载蛋白的外泌体的制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种包载蛋白的外泌体的制备方法与应用。所述的外泌体制备方法采用重组表达外源目的蛋白的方法，包括蛋白的瞬时表达和稳定表达，通过工程化大规模培养细胞的手段，获得大量包含外源目的蛋白的外泌体。本发明专利技术的培养过程不需要添加血清，免除了外泌体提取过程中血清囊泡的污染；通过规模培养细胞来获取大量装载具有生物活性抗体的外泌体，为外泌体的产业化提供了可能性，具有良好的产业化前景。同时，通过本发明专利技术的制备方法所得到的外泌体包载了活性蛋白，可以更易于透过组织和细胞膜，以及血脑屏障，到达病灶部位用于肿瘤等疾病的治疗；也可以用于护肤品，更易于透过皮肤，应用广泛。

Preparation and application of a protein-encapsulated exosome

The invention provides a preparation method and application of protein-encapsulated exosomes. The exosome preparation method adopts the method of recombinant expression of exogenous target proteins, including transient and stable expression of proteins, and obtains a large number of exosomes containing exogenous target proteins by means of large-scale engineering culture of cells. The cultivation process of the present invention does not need to add serum to avoid the contamination of serum vesicles in the process of extracting exosomes; a large number of exosomes loaded with bioactive antibodies are obtained by large-scale culturing cells, which provides the possibility for the industrialization of exosomes and has a good prospect for industrialization. At the same time, the exosomes obtained by the preparation method of the present invention contain active proteins, which can easily penetrate tissues and cell membranes, as well as blood-brain barrier to reach the lesion site for the treatment of tumors and other diseases, and can also be used for skin care products, which are easier to penetrate the skin and are widely used.

【技术实现步骤摘要】
一种包载蛋白的外泌体的制备方法与应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种包载蛋白的外泌体的制备方法与应用。
技术介绍
传统药物，无论是化学药物还是中药，往往存在水溶性差、易被人体快速清除、生物相容性差、体内分布不理想和向细胞渗透能力低等缺陷，而生物药物如蛋白质药物也存在易降解，不稳定的问题。因而人们研制了不同的药物投递系统以解决以上问题，例如脂质体等纳米颗粒。然而，这些化学合成的包载颗粒存在许多问题，其中最重要的一点是，可能会引起很强的免疫反应。1981年，Trams等在透射电镜下发现了一组比多泡体还要小的、直径在40～1000nm的囊泡样物质。1987年，Johnstone等命名这种膜泡为外泌体(exosomes)，其产生的主要过程，可概括为：(1)细胞质膜凹陷形成细胞内小泡；(2)细胞内小泡进一步发展形成多泡小体；(3)多泡小体与细胞质膜融合释放外泌体，受体细胞对外泌体的接收可以通过配体-受体相互作用、胞饮/吞噬或膜融合来实现。从其产生过程可以看出，外泌体是细胞膜成分的囊泡，内里可以携带诸如RNA，蛋白质等大量成分。这也使得人们产生了将这种细胞天然产生的外泌体作为药物包载系统的想法。外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在：(1)当使用自源外泌体时，外泌体引起的有害免疫反应极低；(2)外泌体在人血液中的稳定性好；(3)向细胞转运“货物”的效率高；(4)外泌体运载药物时具有一定的靶向性；(5)外泌体直径在40～100nm之间，因此可以很好地利用增强渗透滞留(EPR)效应，有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。目前已经尝试用外泌体携带siRNA，化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。然而对于大分子蛋白质药物，用现在常用的电穿孔，转染，孵育等包载药物的手段则非常困难。因此，如何高效地获得包载蛋白的外泌体亟待研究突破。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种包载蛋白的外泌体的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供所述的包载蛋白的外泌体的制备方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种包载蛋白的外泌体的制备方法，包括如下步骤：(1)构建含有外源目的蛋白基因片段的重组表达载体，(2)将所述的重组表达载体转染细胞进行表达，培养转染后的细胞，使细胞分泌载有所述外源目标蛋白的外泌体；①当所述的表达为瞬时表达时，具体步骤为：A.细胞的培养：将培养至对数生长期的细胞以细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/mL接种到培养基中，在36～38℃，3～7％CO2，转速160～200rpm下于Tubespin管振荡悬浮培养60～84h，扩增到1L培养摇瓶中细胞活率维持在90％左右；B.将所述的重组表达载体转染细胞，转染后的细胞在36～38℃，4～8％CO2，转速160～200rpm下悬浮培养，当细胞活率低于30％终收样；②当所述的表达为稳定表达时，具体步骤为：A.将所述的重组表达载体转染细胞，培养当天细胞活率大于90％在克隆培养基中培养，在第12～14天用ELISA方法测定蛋白表达情况，选出表达量高的克隆扩增至12孔板；在第12～14天再次用ELISA方法测定蛋白表达情况，筛选出高表达克隆到Tubespin管培养，得到表达量高的稳定表达细胞；B.表达量高的稳定表达细胞的大规模培养：将培养至对数生长期的细胞以细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/mL接种到培养基中，在36～38℃，3～7％CO2，转速160～200rpm下于Tubespin管振荡悬浮培养60～84h，扩增到1L培养摇瓶中，培养60～84h后转移到5L发酵罐中，培养60～84h后转移到20L发酵罐中，培养60～84h后转移到200L发酵罐中；通过所述的大规模培养，培养15～18天，细胞活率可以维持在80％左右，细胞最高密度可以达到1.0～3.0×107个/mL；(3)从细胞培养上清分离得到所述的外泌体。所述的细胞优选为CHO细胞或者HEK293F细胞中的至少一种。当所述的细胞为CHO细胞，所述的培养基优选为Lonza公司的ProCHO5培养基；当所述的细胞为HEK293F细胞时，所述的培养基优选为Sigma公司的293无血清培养基。所述的表达载体优选为pcDNATM3.4。本专利技术的制备方法可适用于多种外源目标蛋白；所述的外源目标蛋白可以根据需要进行选择，例如HER2抗体、重组融合蛋白TNFR-Fc等等。所述的分离优选为通过超速离心方法或外泌体提取试剂盒从所述的细胞培养上清中分离得到所述的外泌体。所述的超速离心方法的具体步骤优选为：(1)300g离心细胞培养上清10min，2000g离心细胞培养上清10～20min，弃沉淀留取第一上清液，以去除细胞；(2)第一上清液10000g离心30min，弃沉淀留取第二上清液，以去除亚细胞成分；(3)第二上清液100000g离心70～90min，弃掉上清液，留取第一沉淀物，所述的沉淀为外泌体和一些可溶性蛋白；(4)用PBS溶液重新悬浮步骤(3)得到的第一沉淀物，混匀后再以100000g离心70～90min，以洗去可溶性蛋白，洗涤沉淀后得到所述的外泌体；步骤(1)～(4)均在4℃下进行。所述的包载蛋白的外泌体的制备方法在基因、蛋白或药物的递送系统的应用。一种外泌体，通过所述的制备方法制备得到。所述的外泌体的粒径为40～200nm。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1.本专利技术采用重组表达外源目的蛋白的方法，包括蛋白的瞬时表达和稳定表达，通过工程化大规模培养细胞的手段，获得大量包含该外源目的蛋白的外泌体。本专利技术采用悬浮培养的CHO细胞或者HEK293F细胞作为表达重组蛋白最主要的表达系统，培养技术已经十分成熟，可以达到107～108个/mL的细胞密度，重组蛋白表达量可以超过10g/L，规模可达到2000L以上。但目前该种培养技术都是用于蛋白表达，还尚未见用于外泌体的生产的。本专利技术通过培养工艺的优化，提高外泌体的产量，培养不需要添加血清，免除了外泌体提取过程中血清囊泡的污染，可通过规模培养CHO细胞或者HEK细胞来获取大量装载具有生物活性抗体的外泌体，使得外泌体可以产业化。2.通过本专利技术制得的外泌体包载了活性蛋白，可以更易于透过组织和细胞膜，以及血脑屏障，到达病灶部位用于肿瘤等疾病的治疗；也可以用于护肤品，更易于透过皮肤。附图说明图1为CHO细胞培养曲线图。图2是实施例2重组HER2抗体质粒的PCR产物电泳图，其中，泳道1～2为HER2抗体重链，3～4为HER2抗体轻链。图3是瞬时表达得到的重组HER2抗体蛋白的还原电泳结果图。图4是CHO细胞稳定表达得到的HER2抗体蛋白的还原电泳图。图5是实施例5提取到的外泌体的透射电镜(TEM)照片图。图6是实施例5的NTA检测外泌体的粒径结果分析图。图7是纯化后的外泌体的Westernblotting结果图；其中，CD9和CD63是外泌体的marker蛋白，外泌体-抗体是表达了HER2抗体的CHO细胞所抽取的外泌体；对照外泌体为空白CHO细胞所抽取的外泌体。图8是含有HER2抗体的外泌体和HER2抗体蛋白抑制肿瘤细胞活性的检测结果图。图9是重组TNFR-Fc质粒的PCR产物电泳图，其中，泳道1为蛋白Marke本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包载蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建含有外源目的蛋白基因片段的重组表达载体，(2)将所述的重组表达载体转染细胞进行表达，培养转染后的细胞，使细胞分泌载有所述外源目标蛋白的外泌体；①当所述的表达为瞬时表达时，具体步骤为：A.细胞的培养：将培养至对数生长期的细胞以细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/mL接种到培养基中，在36～38℃，3～7％CO2，转速160～200rpm下于Tubespin管振荡悬浮培养60～84h，扩增到1L培养摇瓶中细胞活率维持在90％左右；B.将所述的重组表达载体转染细胞，转染后的细胞在36～38℃，4～8％CO2，转速160～200rpm下悬浮培养，当细胞活率低于30％终收样；②当所述的表达为稳定表达时，具体步骤为：A.将所述的重组表达载体转染细胞，培养当天细胞活率大于90％在克隆培养基中培养，在第12～14天用ELISA方法测定蛋白表达情况，选出表达量高的克隆扩增至12孔板；在第12～14天再次用ELISA方法测定蛋白表达情况，筛选出高表达克隆到Tubespin管培养，得到表达量高的稳定表达细胞；B.表达量高的稳定表达细胞的大规模培养：将培养至对数生长期的细胞以细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/mL接种到培养基中，在36～38℃，3～7％CO2，转速160～200rpm下于Tubespin管振荡悬浮培养60～84h，扩增到1L培养摇瓶中，培养60～84h后转移到5L发酵罐中，培养60～84h后转移到20L发酵罐中，培养60～84h后转移到200L发酵罐中；(3)从细胞培养上清分离得到所述的外泌体。...

【技术特征摘要】
1.一种包载蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建含有外源目的蛋白基因片段的重组表达载体，(2)将所述的重组表达载体转染细胞进行表达，培养转染后的细胞，使细胞分泌载有所述外源目标蛋白的外泌体；①当所述的表达为瞬时表达时，具体步骤为：A.细胞的培养：将培养至对数生长期的细胞以细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/mL接种到培养基中，在36～38℃，3～7％CO2，转速160～200rpm下于Tubespin管振荡悬浮培养60～84h，扩增到1L培养摇瓶中细胞活率维持在90％左右；B.将所述的重组表达载体转染细胞，转染后的细胞在36～38℃，4～8％CO2，转速160～200rpm下悬浮培养，当细胞活率低于30％终收样；②当所述的表达为稳定表达时，具体步骤为：A.将所述的重组表达载体转染细胞，培养当天细胞活率大于90％在克隆培养基中培养，在第12～14天用ELISA方法测定蛋白表达情况，选出表达量高的克隆扩增至12孔板；在第12～14天再次用ELISA方法测定蛋白表达情况，筛选出高表达克隆到Tubespin管培养，得到表达量高的稳定表达细胞；B.表达量高的稳定表达细胞的大规模培养：将培养至对数生长期的细胞以细胞接种后最终浓度为4×105～6×105个/mL接种到培养基中，在36～38℃，3～7％CO2，转速160～200rpm下于Tubespin管振荡悬浮培养60～84h，扩增到1L培养摇瓶中，培养60～84h后转移到5L发酵罐中，培养60～84h后转移到20L发酵罐中，培养60～84h后转移到200L发酵罐中；(3)从细胞培养上清分离得到所述的外泌体。2.根据权利要求1所述的包载蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述的细胞为CHO细胞和HEK293F细胞中的至少一种。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：谢秋玲，季煜华，熊盛，陈静，卢加，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44