磷脂酶C及其编码基因制造技术

本发明专利技术涉及磷脂酶C及其编码基因。还涉及包含所述基因的载体以及宿主细胞。此外，还涉及所述生产所述磷脂酶C的方法以及所述磷脂酶C的用途。

Phospholipase C and its coding genes

The present invention relates to phospholipase C and its coding gene. Vectors containing the genes and host cells are also involved. In addition, the method for producing the phospholipase C and the use of the phospholipase C are also involved.

【技术实现步骤摘要】
磷脂酶C及其编码基因
本专利技术涉及一种新的磷脂酶C及其编码基因。还涉及包含所述基因的载体以及宿主细胞。此外，还涉及所述生产所述磷脂酶C的方法以及所述磷脂酶C的用途。
技术介绍
在制造植物类食用油时，初步经过压榨和浸出等方法从油料种子种提取而得的毛油，一般含有蛋白质、甾醇、磷脂、色素、痕量金属、游离脂肪酸等杂质，影响食用油品质，通常无法食用。所以，需要进行油脂精炼。脱胶是植物油精炼过程中非常重要的一个环节。近年来，酶法脱胶技术由于其反应条件温和、精炼得率高、环保及适用范围广等特点，得到了市场的广泛关注。磷脂酶是一类广泛存在于动物、植物和微生物中，能够特异性水解甘油磷脂的酶。根据磷脂酶与磷脂作用位点的不同，可将磷脂酶分为磷脂酶A1（PLA1），磷脂酶A2（PLA2），磷脂酶B（PLB），磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）。目前，在植物油脱胶过程中，主要使用的是PLA1、PLA2、PLB和PLC。PLA1和PLA2能特异性水解磷脂的Sn-1或Sn-2位酯键，生成相应的溶血磷脂；PLB能将Sn-1和Sn-2位的酯键都水解，生成相应的甘油酰磷脂。溶血磷脂和甘油酰磷脂都具有很强的亲水性，通过水合作用可以方便地除去。PLC能特异性水解磷脂Sn-3位上甘油磷酸酯键，生成相应的甘二酯（DAG）和磷酯酸，而DAG作为中性油在后续的精炼过程中不会被去除，因而能有效提高油脂精炼后的得率。蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的磷脂酰胆碱-磷脂酶C(BC-PC-PLC)，是研究较早的一种磷脂酶C。BC-PC-PLC全长为283个氨基酸，其中包含24个氨基酸的信号肽和14个氨基酸的前导肽，成熟肽为245个氨基酸(Johansen,T.,Holm,T.,Guddal,P.H.,Sletten,K.,Haugli,F.B.,Little,C.(1988)."Cloningandsequencingofthegeneencodingthephosphatidylcholine-preferringphospholipaseCofBacilluscereus."Gene65(2):293-304)。BC-PC-PLC的晶体结构已经被报道，其由多个螺旋结构域组成，催化位点为55位天冬氨酸，并且含有至少三个Zn2+结合位点(Hough.,E.,Hansen,L.K.,Birknes,B.,Jynge,K.,Hansen,S.,Hordvik,A.,Little,C.,Dodson,E.,Derewenda,Z.(1989)"High-resolution(1.5A)crystalstructureofphospholipaseCfromBacilluscereus."Nature.338:357-60)。在之前的研究中，专利CN104630174A中通过将BC-PC-PLC的三个糖基化位点即63位，131位和134位天冬酰胺分别突变为天冬氨酸，丝氨酸和天冬氨酸，从而使突变序列表现出的酶活相比于原始序列提高16倍；专利CN2016/110030中在糖基化位点突变序列的基础上再将第56位酪氨酸突变为组氨酸，从而提供一种在低硫酸锌条件下表现出高磷脂酶酶活的变体，相较糖基化位点突变序列，在10μM硫酸锌的条件下，酶活提高了7倍。为了进一步提高该磷脂酶C的脱胶效率，本申请的专利技术人继续对该磷脂酶C进行突变，希望能够得到酶活进一步提高的突变体，从而能够得到更高效的磷脂酶C，提高脱胶效率，增加脱胶过程中甘二酯(DAG)的得率。
技术实现思路
本专利技术在上述现有技术的所有突变的基础上再将BC-PC-PLC第10位的甘氨酸突变为天冬氨酸，其比酶活比突变前的序列提高了83%，且蛋白表达量和单位酶活的脱胶活性没有变化，从而进一步降低了生产成本。具体地，本专利技术涉及磷脂酶C，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQIDNO:4的功能。本专利技术还涉及源自蜡样芽孢杆菌的磷脂酶C，其氨基酸序列选自：具有与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列90%以上，优选95%以上，更优选96%以上、更优选97%以上，更优选98%以上，更优选99%以上同源性，且位点10为天冬氨酸；优选的，所述氨基酸序列的位点56为组氨酸、位点63为天冬氨酸、位点131为丝氨酸、和/或位点134为天冬氨酸。本专利技术还涉及核酸分子，选自：(a)编码本专利技术的磷脂酶C的核苷酸序列；以及(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术进一步涉及载体，其包含上文所述的核酸分子。本专利技术还涉及包含上文所述核酸分子或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以选自细菌细胞、真菌细胞，优选酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。本专利技术还涉及生产磷脂酶C的方法，包括在宿主细胞中表达编码本专利技术的磷脂酶C的核酸分子，并且回收得到的多肽。本专利技术进一步涉及本专利技术的磷脂酶C在油脂脱胶中的用途。本专利技术还涉及组合物，其包含本专利技术的磷脂酶C或本专利技术的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液。本专利技术另外涉及本专利技术的宿主细胞的发酵液、发酵上清或发酵浓缩液。本专利技术还涉及油脂脱胶的方法，其特征在于，所述方法将本专利技术的磷脂酶C或本专利技术的组合物或本专利技术的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液用于所述油脂脱胶。附图说明图1是磷脂酶C变体大豆磷脂筛选平板图。图2是磷脂酶C变体等酶活SDS-PAGE蛋白电泳图。图3显示磷脂酶mPLC、m2PLC和Purifine®的脱胶实验结果。序列说明SEQIDNO:1是引入了Y56H、N63D、N131S、N134D突变的磷脂酶C，即mPLC的DNA编码序列。SEQIDNO:2是引入了Y56H、N63D、N131S、N134D突变的磷脂酶C，即mPLC的氨基酸序列。SEQIDNO:3是引入了G10D、Y56H、N63D、N131S、N134D突变的磷脂酶C，即m2PLC的DNA编码序列。SEQIDNO:4是引入了G10D、Y56H、N63D、N131S、N134D突变的磷脂酶C，即m2PLC的氨基酸序列。SEQIDNO:5和6是引物对PLC-F/PLC-R的序列。具体实施方式本专利技术涉及磷脂酶C，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQIDNO:4的功能。在一个实施方案中，本专利技术的磷脂酶C的序列如SEQIDNO:4所示。此外，本专利技术的SEQIDNO:4还可以具有氨基酸残基的一个或几个，例如1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2个缺失、插入或取代，这些改动产生沉默变化或者产生功能上等效的酶。在保持酶活性的情况下，被设计的氨基酸取代可以根据残基在极性、电荷、可溶性、亲水性、疏水性和/或双亲性质上的相似性。例如，带本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.磷脂酶C，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO: 4的功能。

【技术特征摘要】
1.磷脂酶C，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQIDNO:4的功能。2.源自蜡样芽孢杆菌的磷脂酶C，其氨基酸序列选自：具有与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列90%以上，优选95%以上，更优选98%以上同源性，且位点10为天冬氨酸；优选的，所述氨基酸序列的位点56为组氨酸、位点63为天冬氨酸、位点131为丝氨酸、和/或位点134为天冬氨酸。3.核酸分子，选自：(a)编码权利要求1或2所述的磷脂酶C的核苷酸序列；(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；以及(c)如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。4.载体，其包含权利要求3的核酸分子。5.宿主细胞，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴伟，戴小军，曹海生，牛其文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31