一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法技术

本发明专利技术提供了一种宫颈细胞裂解试剂盒及细胞裂解方法，属于细胞裂解技术领域，所述试剂盒包括裂解缓冲液和蛋白酶K；所述裂解缓冲液包括以下浓度的组分：10～500mM的Tris‑HCl、1～80mM的EDTA、0.05～2wt％SDS和100～250mM NaCl。所述细胞裂解方法包括以下步骤：PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液后，与裂解缓冲液混合均匀，加入蛋白酶K混合，53～58℃消化10～14h；然后涡旋震荡30～60s后，53～58℃继续消化1.5～2.5h完成细胞裂解；所述试剂盒及裂解方法能够充分裂解样品中的宫颈细胞，解离出高浓度和高质量的DNA，利于后续DNA的提取和扩增。

A Kit for Cervical Cell Lysis and Its Lysis Method

The invention provides a cervical cell lysis kit and a cell lysis method, which belongs to the technical field of cell lysis. The kit comprises a lysis buffer and proteinase K. The lysis buffer comprises components of the following concentration: Tris_HCl of 10-500 mM, EDTA of 1-80 mM, SDS of 0.05-2 wt% and NaCl of 100-250 mM. The cell lysis method comprises the following steps: after cleaning the cervical cell sample solution with PBS buffer, it is evenly mixed with the lysis buffer, mixed with protease K, digested for 10-14 hours at 53-58 C, then digested for 1.5-2.5 hours at 53-58 C after 30-60 s turbulence; the kit and the lysis method can fully lyse the cervical cells in the sample and produce high dissociation rate. Concentration and high quality DNA are conducive to subsequent DNA extraction and amplification.

【技术实现步骤摘要】
一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法
本专利技术属于细胞裂解
，尤其涉及一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法。
技术介绍
宫颈癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一，有效的筛查和早期诊断，能够显著降低宫颈癌的发生率与死亡率。宫颈液基薄层细胞学检测(TCT)已经成为宫颈癌筛查和细胞学诊断的常用方法之一。TCT检测是一种将脱落细胞保存在保存液中，并通过专用制片仪器将细胞均匀分散黏附到载玻片上，进行染色观察的技术。临床采集样本时，应用特制的宫颈刷插入宫颈口，刷取宫颈口和宫颈管的脱落上皮细胞，将宫颈刷的刷头置于装有细胞保存液的小瓶中进行漂洗，获得细胞样本。之后，保存液中的细胞经混匀、过滤、转移，最终黏附于载波片上，染色固定后进行细胞学诊断。但由于检测人员主观因素等原因宫颈液基薄层细胞学检测仍存在漏检的情况，因此，目前宫颈癌的诊断，也不能单靠细胞学检查；此外，现阶段肿瘤治疗寻求的是精准个性化治疗，有必要从基因学角度对受试者进行宫颈癌相关基因的检测。而提取高浓度高质量的细胞DNA的前提是充分裂解细胞，细胞裂解可通过机械作用、化学作用和酶作用来实现。TCT检测过程中，保存液能够很好的保存宫颈细胞，而且受检者承受痛苦小，无疑是宫颈癌基因学检测的最佳样本。TCT检测宫颈细胞保存液中含有细胞成分和非细胞成分；细胞成分包括上皮细胞和非上皮细胞，上皮细胞包括鳞状细胞和宫颈管细胞，非上皮细胞包括血细胞，如红细胞等，以及间质细胞。非细胞成分包括固有成分，如黏液、细菌等，以及污染物，如药物结晶、纤维物、真菌等。因此，保存液中除了上皮细胞，其他成分均为干扰项。另外，保存液中还含有固定细胞的化学成分，这类化学成分会使DNA与蛋白质发生交联，影响DNA的释放，因此保存液本身亦是提取宫颈细胞DNA的干扰项。由于样本中的干扰项众多，现有的商业化试剂盒根本无法将DNA从宫颈TCT保存液中充分解离出，由此提取的DNA质量和浓度均不达标，无法进行后续的扩增实验，更无法获得准确的基因检测结果。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种针对宫颈液基薄层细胞学检测保存液样本的宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法；所述试剂盒及裂解方法能够充分裂解样品中的宫颈细胞，解离出高浓度和高质量的DNA，利于后续DNA的提取和扩增。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种宫颈细胞裂解试剂盒，包括裂解缓冲液和蛋白酶K；所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10～500mM的Tris-HCl、1～80mM的EDTA、0.05～2wt％SDS和100～250mMNaCl。优选的，所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：50～400mM的Tris-HCl、5～60mM的EDTA、0.1～1wt％SDS和150～220mMNaCl。优选的，所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：100mM的Tris-HCl、50mM的EDTA、0.1wt％SDS和200mMNaCl。优选的，所述Tris-HCl的pH值为8.0～8.3。本专利技术还提供了所述试剂盒裂解宫颈细胞的方法，包括以下步骤：1)PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液，固液分离，收集固相组分；2)将所述固相组分与裂解缓冲液混合，获得混合液；3)将所述混合液与蛋白酶K溶液混合，进行第一阶段消化，所述第一阶段消化的温度为53～58℃，时间为10～14h，获得消化液；4)将所述消化液涡旋震荡30～60s后，继续进行第二阶段消化，所述第二阶段消化的温度为53～58℃，时间1.5～2.5h；所述宫颈细胞样本液来源于临床宫颈TCT检测获得的含有宫颈细胞的保存液。优选的，所述PBS缓冲液与宫颈细胞样本液的体积比为1～5:1。优选的，步骤2)中所述的裂解缓冲液与步骤1)中所述的宫颈细胞样品液的体积比为(1～5)：(8～12)。优选的，所述蛋白酶K溶液的浓度为0.1～2mg/ml。优选的，步骤2)中所述的裂解缓冲液与步骤3)中所述的蛋白酶K溶液的体积比为(15～25)：1。优选的，所述第一阶段消化和第二阶段消化的温度独立为54～56℃。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的宫颈细胞裂解试剂盒包括裂解缓冲液和蛋白酶K；所述裂解缓冲液中Tris-HCl提供缓冲体系；EDTA作为二价金属离子螯合剂，能够抑制细胞中DNase活性；表面活性剂SDS能够溶解脂质和蛋白质，破坏细胞膜和核膜结构，使细胞破裂，且SDS还能使蛋白质和多糖变性，使DNA与其相连的蛋白质分离，释放出来；NaCl利于DNA溶解；所述蛋白酶K，在SDS和EDTA存在下保持很高的活性，能将所有蛋白降解成为多肽或小片段氨基酸，使DNA分子完整的被分离出来。本专利技术所述的试剂盒将上述成分有机组合，能够排除其他细胞、粘液、药物结晶、保存液中的化学成分等的干扰，有效地将临床宫颈TCT检测获得的保存液中的宫颈细胞完全裂解。利用本专利技术提供的试剂盒以及裂解方法获得的临床宫颈TCT检测过程中的含有宫颈细胞保存液样本的细胞裂解液，进行常规DNA提取，获得的DNA浓度可以达到100-300ng/μl，260/280值1.85-2.05，260/230值1.5-1.9；以提取的DNA为模板进行PCR扩增后，管家基因的扩增曲线良好，CT值在25-27之间。由此可见，利用本专利技术提供的试剂盒获得的裂解液进行DNA提取，能够获得高质量、高浓度的DNA，有利于后续DNA的扩增和基因检测。具体实施方式细胞裂解是细胞DNA提取的首要关键步骤，细胞裂解是否充分，DNA释放是否完全，直接决定DNA提取的纯度和浓度，影响后续PCR实验的结果。临床TCT检测保存液中的脱落宫颈细胞细胞量少，且后续要进行PCR检测实验，常规的细胞裂解方法并不适用。本专利技术采用将化学作用与酶作用相结合的方法，可以降低对细胞量的需求，且较温和，能够获得完整的DNA链。本专利技术提供了一种宫颈细胞裂解试剂盒，所述试剂盒的裂解对象为宫颈液基薄层细胞学检测保存液样本中的宫颈细胞；所述试剂盒也可以用来裂解其他形式的细胞。本专利技术中，所述试剂盒包括裂解缓冲液和蛋白酶K；所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10～500mM的Tris-HCl、1～80mM的EDTA、0.05～2wt％SDS和100～250mMNaCl。在本专利技术中，所述裂解缓冲液以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：50～400mM的Tris-HCl、5～60mM的EDTA、0.1～1wt％SDS和150～220mMNaCl；更优选的，包括以下浓度的组分：100mM的Tris-HCl、50mM的EDTA、0.1wt％SDS和200mMNaCl。在本专利技术中，所述裂解缓冲液中Tris-HCl的pH值优选为8.0～8.3，更优选为8.1～8.2；所述Tris-HCl的作用是提供缓冲体系，使整个体系的pH维持在弱碱性的范围内；本专利技术中所述EDTA作为二价金属离子螯合剂，能抑制细胞中DNase活性；SDS为强变性剂和蛋白溶解剂，去污剂，能溶解细胞膜和核膜，破坏细胞，并将DNA与其相连的蛋白质分离；NaCl利于DNA溶解。本专利技术对所述裂解缓冲液中各个成分的来源没有特殊限定，采用市售产品即可。本专利技术对所述蛋白酶K的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售蛋白酶K即可；本专利技术中，所述试剂盒中的蛋白酶K优选为市售蛋白酶K粉末或蛋白酶K本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种宫颈细胞裂解试剂盒，其特征在于，包括裂解缓冲液和蛋白酶K；所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10～500mM的Tris‑HCl、1～80mM的EDTA、0.05～2wt％SDS和100～250mM NaCl。

【技术特征摘要】
1.一种宫颈细胞裂解试剂盒，其特征在于，包括裂解缓冲液和蛋白酶K；所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10～500mM的Tris-HCl、1～80mM的EDTA、0.05～2wt％SDS和100～250mMNaCl。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括以下浓度的组分：50～400mM的Tris-HCl、5～60mM的EDTA、0.1～1wt％SDS和150～220mMNaCl。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解缓冲液包括以下浓度的组分：100mM的Tris-HCl、50mM的EDTA、0.1wt％SDS和200mMNaCl。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl的pH值为8.0～8.3。5.利用权利要求1～4任意一项所述试剂盒裂解宫颈细胞的方法，包括以下步骤：1)PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液，固液分离，收集固相组分；2)将所述固相组分与裂解缓冲液混合，获得混合液；3)将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖晶，李楠，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21