一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法及该菌种的应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法及该菌种的应用。本发明专利技术以鱿鱼内脏作为唯一底物，将未知菌液与鱿鱼内脏一同发酵培养，将鱿鱼内脏发酵液稀释后涂布到无菌培养基上培养，观察培养后的菌落的形态，选取菌落数量最多的三种形态的菌落，将挑选出的三种菌落分别划线到无菌培养基中进行分离纯化，纯化得到的三种菌株便为降解鱿鱼内脏的优势菌株。本发明专利技术通对未知组成成分的混合菌液进行特定菌种的筛选，分离筛选出能高效利用鱿鱼下脚料废物的优势菌种。通过本发明专利技术的方法能够将鱿鱼内脏再利用，提取其中的营养物质，避免浪费，同时也避免了环境污染。

A Method for Screening Strains from Squid Viscera and Its Application

The invention relates to the field of biotechnology, and discloses a method for screening bacteria by using squid viscera and the application of the bacteria. The invention takes squid viscera as the sole substrate, ferments the unknown bacterial liquid with squid viscera, dilutes the squid viscera fermentation liquid and spreads it on the aseptic culture medium for culture, observes the morphology of the cultured colonies, selects the three colonies with the largest number of bacterial colonies, and separately lines the selected three colonies into the aseptic culture medium for separation and purification. The three strains were the dominant strains to degrade squid viscera. The invention screens specific strains of mixed bacterial liquid with unknown components, and isolates and screens dominant strains that can efficiently utilize squid waste. The method of the invention can reuse squid viscera, extract nutrients therein, avoid waste and avoid environmental pollution.

【技术实现步骤摘要】
一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法及该菌种的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法及该菌种的应用。
技术介绍
海产品内脏是指在海产品加工过程中产生的废料，以及一些边角料，但所含营养成分极其丰富。鱿鱼也被称为枪乌贼，海洋软体动物，其加工过程中产生约20-25％的废物，其中脏腑占大多数，其次是皮，眼睛，软骨和精白。这些副产物富含牛磺酸、蛋白质、软骨素、胶原蛋白、蛋白多糖、甲壳素等营养物质。胶原蛋白常应用于化妆品与医疗保健品中，将胶原蛋白从胶原溶液中提取出来可以辅助用于医药行业。但是由于目前加工厂技术有限，对这些副产物的利用价值也不明确，就采取直接就地掩埋的方式处理了，或者进行一些简单的粗加工，干燥完后做成鱼粉饲料，这样做不仅浪费了鱿鱼的很多营养物质，也污染了环境，更严重的会引起经济和健康问题。中国专利申请公开号为CN104938604B的专利，公开了一种水产加工下脚料综合利用方法。该方法是以鱼、虾、蟹等甲壳动物加工下脚料为原料，通过清洗、低温干燥、冷冻粉碎、复合酶降解、有机酸提取、离心分离、反渗透脱水、分子包埋、高压均质、真空低温冷冻式干燥、制粒、压片、自动瓶装包装生产线、外包装等全套工艺，将水产加工下脚料中所有高附加值的生物活性成分——虾青素、蛋白质、有机钙和甲壳素及其衍生物壳聚糖等一并提取出来。但该方法操作复杂，用水量大，浪费水资源。同时，该专利技术中的地下无动力生态污水处理系统深埋在地底深处，施工难度大。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法及该菌种的应用。本专利技术对鱿鱼内脏废弃物进行再加工，结合微生物发酵作用，对其回收，提取其营养物质。本专利技术以鱿鱼内脏作为唯一底物，对未知组成成分的混合菌液进行特定菌种的筛选，分离筛选出能高效利用下脚料废物的优势菌种。能够将鱿鱼内脏废弃物再利用，提取其中的营养物质，避免浪费，同时也避免了环境污染。本专利技术的具体技术方案为：一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，包括以下步骤：(1)无菌环境下，将鱿鱼内脏灭菌后均浆为半固体；(2)无菌环境下，将半固体的鱿鱼内脏、无菌水和混合菌液一起发酵培养，得鱿鱼内脏发酵液；(3)无菌条件下，将鱿鱼内脏发酵液用无菌水进行梯度稀释，将稀释后的鱿鱼内脏发酵液涂布在无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；(4)无菌条件下，挑取数量最多的三种不同形态的菌落，依次命名为X1、X2、X3，每种形态的单菌落分别划线在不同的无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；(5)无菌条件下，将经步骤(4)培养的分别划线有X1、X2、X3的培养基中X1、X2、X3的单菌落再次划线到无菌培养基中培养；重复划线至少3次，最后得到的菌种即为分离纯化后的菌种X1、X2、X3。本专利技术以鱿鱼内脏作为唯一底物，将未知菌液与鱿鱼内脏一同发酵培养，将鱿鱼内脏发酵液稀释后涂布到无菌培养基上培养，观察培养后的菌落的形态，选取菌落数量最多的三种形态的菌落，将挑选出的三种菌落分别划线到无菌培养基中进行分离纯化，纯化得到的三种菌株便为降解鱿鱼内脏的优势菌株。本专利技术通对未知组成成分的混合菌液进行特定菌种的筛选，分离筛选出能高效利用下脚料废物的优势菌种。通过本专利技术的方法能够将鱿鱼内脏废弃物再利用，提取其中的营养物质，避免浪费，同时也避免了环境污染。作为优选，步骤(2)中，所述鱿鱼内脏、无菌水的料水比为1:1～9，混合菌液的添加量为鱿鱼内脏悬液体积的3～25％。作为优选，所述混合菌液的添加量为鱿鱼内脏悬液体积的3～8％。专利技术人经过大量的实验发现，当混合菌液的添加量为鱿鱼内脏悬液体积的3～8％时，发酵培养的效果最好。由于鱿鱼内脏被均浆成半固体状，混合菌液与鱿鱼内脏容易混合均匀，发酵培养时添加较少的混合菌液即可达到良好的降解效果。当混合菌液的量过少时，发酵速度慢，降解不完全。当混合菌液的量过多时，会导致菌液在短时间内达到平稳期，进而很快进入衰退期，导致菌落数量减少，也不利于发酵的进行。专利技术人经过大量的实验发现，当混合菌液的添加量为蟹下脚料悬液体积的3～8％时，发酵培养的效果最好。作为优选，所述混合菌液中的菌群包括光合菌群、酵母菌群、革兰氏阳性放线菌群和发酵系的丝状菌群，混合菌液的质量百分浓度为0.4～1％。混合菌液为商业的包含光合菌群、酵母菌群、革兰氏阳性放线菌群和发酵系的丝状菌群的菌液，其与鱿鱼内脏一同发酵时必然存在某几种发酵鱿鱼内脏的优势菌落，将其分离纯化可得到能高效降解鱿鱼内脏的优势菌落。当混合菌液的浓度为0.4～1wt％时，混合菌液与鱿鱼内脏一同发酵的鱿鱼内脏发酵液中的不同形态的菌落容易区分，容易挑选出优势的菌落。当混合菌液的浓度过高时，鱿鱼内脏发酵液中不同形态的菌落不容易区分，优势菌株的分离纯化困难。当混合菌液的浓度过低时，发酵时间过长。作为优选，步骤(2)中，所述发酵培养的温度为28～30℃，摇床转速为100～120r/min，培养时间为1～2d。在本专利技术的培养条件下，发酵培养效果最好。作为优选，步骤(3)中，所述稀释后的鱿鱼内脏发酵液为三个梯度，分别为梯度稀释前浓度的10-4、10-5、10-6倍的鱿鱼内脏发酵液，所述培养的条件与步骤(2)中培养的条件相同。作为优选，步骤(3)、(4)、(5)中，所述的无菌培养基为购于青岛海博生物技术有限公司的营养琼脂培养基经121℃灭菌30min得到的。作为优选，对步骤(5)中所述的分离纯化后的菌株X1、X2、X3进行鉴定，鉴定方法为：将分离纯化后的菌株X1、X2、X3分别划线到营养肉汤固体培养基平板上，将营养肉汤固体培养基平板上长出来的菌落进行革兰氏染色后在显微镜下观察菌落形态；同时，经过细菌基因组提取、特异引物扩增16SrDNA序列、纯化PCR产物、DNA测序获得X1、X2、X3的16SrDNA序列，得到的X1、X2、X3的16SrDNA序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示。菌株X1的16SrDNA核苷酸序列为：CCCTCTAGATGCATGCTCGAGGGAGAGTTTGATCAGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGAGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGGCGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）无菌环境下，将鱿鱼内脏灭菌后均浆为半固体；（2）无菌环境下，将半固体的鱿鱼内脏、无菌水和混合菌液一起发酵培养，得鱿鱼内脏发酵液；（3）无菌条件下，将鱿鱼内脏发酵液用无菌水进行梯度稀释，将稀释后的鱿鱼内脏发酵液涂布在无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；（4）无菌条件下，挑取数量最多的三种不同形态的菌落，依次命名为X1、X2、X3，每种形态的单菌落分别划线在不同的无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；（5）无菌条件下，将经步骤（4）培养的分别划线有X1、X2、X3的培养基中X1、X2、X3的单菌落再次划线到无菌培养基中培养；重复划线至少3次，最后得到的菌种即为分离纯化后的菌种X1、X2、X3。

【技术特征摘要】
1.一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）无菌环境下，将鱿鱼内脏灭菌后均浆为半固体；（2）无菌环境下，将半固体的鱿鱼内脏、无菌水和混合菌液一起发酵培养，得鱿鱼内脏发酵液；（3）无菌条件下，将鱿鱼内脏发酵液用无菌水进行梯度稀释，将稀释后的鱿鱼内脏发酵液涂布在无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；（4）无菌条件下，挑取数量最多的三种不同形态的菌落，依次命名为X1、X2、X3，每种形态的单菌落分别划线在不同的无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；（5）无菌条件下，将经步骤（4）培养的分别划线有X1、X2、X3的培养基中X1、X2、X3的单菌落再次划线到无菌培养基中培养；重复划线至少3次，最后得到的菌种即为分离纯化后的菌种X1、X2、X3。2.如权利要求1所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述鱿鱼内脏、无菌水的料水比为1:1~9，混合菌液的添加量为鱿鱼内脏悬液体积的3~25%。3.如权利要求2所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：所述混合菌液的添加量为鱿鱼内脏悬液体积的3~8%。4.如权利要求3所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：所述混合菌液中的菌群包括光合菌群、酵母菌群、革兰氏阳性放线菌群和发酵系的丝状菌群，混合菌液的质量百分浓度为0.4~1%。5.如权利要求1所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述发酵培养的温度为28~30℃，摇床转速为100~120r/min，培养时间为1~2d。6.如权利要求1所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述稀释后的鱿鱼内脏发酵液为三个梯度，分别为梯度稀释前浓度的10-4、10-5、10-6倍的鱿鱼内脏发酵液，所述培养的条件与步骤（2）中培养的条件相...

【专利技术属性】
技术研发人员：闻正顺，李怡，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33