一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法技术

测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法，属于微生物活性测定领域，可解决测定氧化亚铁硫杆菌活性的方法复杂、时间长、效率低的问题。用化学发光测量仪器，配制Fe

【技术实现步骤摘要】
一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法
本专利技术属于微生物的活性测定
，具体涉及一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法。
技术介绍
氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxidans，简称A.ferrooxidans）属原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属，革兰氏阴性菌，是专性化能自养菌，营好氧呼吸，嗜酸。广泛分布在土壤、海水、淡水、污泥、垃圾、煤矸石、酸性矿坑水中，尤其是在矿坑水中含量巨大。由于氧化亚铁硫杆菌以元素硫、亚铁离子为能源物质进行生长代谢，因此对于大部分金属硫化物矿山环境或者含硫量高的其它固体废弃物，它是最好的脱硫微生物。且能通过直接作用或其代谢产物的间接作用，产生氧化、还原、络合、吸附或溶解作用，达到浸出固相中重金属的效果。目前已在市政污泥、污泥重金属脱除、矿山冶金等领域成熟应用。由于氧化亚铁硫杆菌以氧化单质硫或还原态的硫或者亚铁来获取生长繁殖所需的能量，所以研究者一般使用硫氧化活性或者亚铁氧化活性来表示氧化亚铁硫杆菌的活性。在实际工程应用中，功能菌株的活性对于浸出重金属含量、污泥降解率、浸出反应速率以及细菌最适生长条件有很大的影响。因此在利用氧化亚铁硫杆菌进行工程应用之前，需要对主要功能菌株氧化亚铁硫杆菌的活性进行准确的测定。作为化能自养细菌，氧化亚铁硫杆菌有其独特的能量利用方式：首先，氧化亚铁硫杆菌以二价铁（Fe2+）或单质硫（S0）以及还原态硫化物为能源，通过这些离子或物质的氧化反应中电子的传递过程来获取能量，这个特点也是它被当做最常用的浸矿微生物的主要原因。氧化亚铁硫杆菌属于嗜酸菌，在pH值为2.0-5.0的范围内都能很好的生长，最适合pH为2.0-3.5，最适生长温度为28-35℃。氧化亚铁硫杆菌生长周期约为6-10d，在9K液体培养基中会使培养基由乳白色液体变为红褐色液体，并伴随有大量沉淀产生。在9K固体培养基上生成红棕色菌落，直径约为0.5-1.0mm，质地坚硬，难以挑起，在菌落的周围会出现一圈铁锈色的沉淀。根据氧化亚铁硫杆菌的理化性质对9K培养基进行改良后开始培养氧化亚铁硫杆菌。氧化亚铁硫杆菌主要利用CO2为碳源，并通过吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。氧化亚铁硫杆菌铁氧化系统中的绝大多数功能成分已得到了鉴定。它包括一个92kD的外膜蛋白，一个称为铁质兰素的小兰铜蛋白，许多c和a型细胞色素及铁（Ⅱ）氧化酶等。目前氧化亚铁硫杆菌硫氧化系统存在两种机制：（1）在硫基础盐培养基中有氧生长时硫氧化以氧为最终电子受体；（2）在铁基础盐培养基中厌氧生长时，它利用三个酶即硫化氢-Fe3+氧化还原酶，亚硫酸-Fe3+氧化还原酶及铁（Ⅱ）氧化酶，共同将元素硫氧化为硫酸。氧化亚铁硫杆菌可氧化硫和硫代硫酸盐等其他部分还原态的硫化物。相对于铁氧化系统来说，硫的氧化研究则进展较慢，其中有生物催化作用的酶有待进一步研究。无论是单质硫，硫代硫酸盐或是其他还原态硫的生物氧化，亚硫酸根离子是一必然的中间产物。在一些化学反应过程中伴随的光发射现象被称作化学发光。反应中产生化学发光现象主要通过两种途径。一类是化学反应中激发态的发光体直接生成；另一类是反应过程中由于能量的转移而间接产生的化学发光。化学发光法的优点主要在于操作简单、背景干扰小、高灵敏度以及高准确度等，易于实现快速定量分析，目前广泛地应用于定量检测化学反应中微量物质。目前国内对于化学发光法的研究多聚焦于检测重金属离子含量。鲁米诺-过氧化氢化学发光反应是应用最为广泛的鲁米诺发光体系。Cu2+、Cr3+、Ni2+、Co2+和Fe2+等过渡金属离子对鲁米诺-过氧化氢化学发光反应有很好的催化作用。其基本原理为：当Fe2+与HO2-配位，生成的配合物再与鲁米诺发生氧化反应，Fe2+失去一个电子变成Fe3+，鲁米诺则被氧化成鲁米诺游离基，随后，鲁米诺游离基进一步被过氧化氢氧化成氨基邻苯二甲酸根离子产生化学发光。因为鲁米诺-H2O2-Fe（Ⅱ）发光体系能够快速准确的测定溶液中亚铁含量，因此本方法使用重铬酸钾滴定法与鲁米诺-H2O2-Fe（Ⅱ）发光体系来测定同一培养周期中不同时间段的亚铁含量，以此来确定使用化学发光法测定氧化亚铁硫杆菌的准确性和可行性。在国内外的关于氧化亚铁硫杆菌的活性研究的试验中，大部分都选择以铁氧化活性来代表细菌的活性。主要有以下几种测定方法：1.重铬酸钾滴定法。如许晓芳等人在研究阳离子对嗜酸性氧化亚铁硫杆菌氧化活性的影响时，使用了重铬酸钾来滴定Fe2+，通过前后变化值来确定亚铁离子的氧化率。2.邻菲罗啉分光光度法。如王艳锦等人在研究载体对氧化亚铁硫杆菌氧化活性的影响时，使用邻菲罗啉分光光度法来测定Fe2+的前后变化值。3.氧化还原电位分析法（ORP计）。如周吉奎等人采用BPP-922型台式氧化还原电位分析仪(ORP计)检测浸出体系氧化还原电位值的变化。4.EDTA滴定法。徐晶晶在研究氧化亚铁硫杆菌符合杀菌剂的作用机理及其缓释技术时，利用EDTA滴定法测定了Fe2+的含量。5.谢丽等人利用流式细胞仪来测定细菌的活性，通过FCM-单染色法以及FCM-双染色法分别测定活性，并取得较好的结果。4.T•O•斯卡恭等人通过一种适于硫化矿精矿槽浸的通过离心方式确定氧化亚铁硫杆菌生物量和通过测定浸出矿浆溶液中Fe2+的氧化速率（g/ml时）来确定细菌氧化活性的快速方法。目前国内外关于氧化亚铁硫杆菌的研究中，一般使用重铬酸钾滴定法来测定Fe2+的氧化率来表示氧化亚铁硫杆菌的铁氧化活性，但使用传统方法测定氧化亚铁硫杆菌活性，操作繁复，需要多次测量，耗费大量时间且检测周期长。而化学发光法具有灵敏度好，准确度高，光背景小等优点，广泛地应用于微量物质的定量分析。使用化学发光法可以快速测定氧化亚铁硫杆菌的活性，迅速而准确。为以后的研究者提供一种新的活性测定思路和方法，并为后续氧化亚铁硫杆菌在工程中的应用提供支持。
技术实现思路
本专利技术针对现有测定氧化亚铁硫杆菌活性的方法操作复杂，时间长，效率低的问题，提供一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法—化学发光法。本专利技术采用如下技术方案：一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法，包括如下步骤：第一步，调整发光仪参数：高压1000V，标准光源14C每秒发光值为1500count/s（发光强度/每秒），背景值6count/s，测量温度30℃；第二步，分别配制浓度为1μg/L、10μg/L、30μg/L、50μg/L、70μg/L、80μg/L、100μg/L的Fe2+标准溶液待用，在样品杯中依次加入鲁米诺分析溶液与H2O2溶液，放入发光仪中开始计时，在第20s时从暗室顶端注射孔中将Fe2+标准溶液注射入样品室，得到反应体系，每种浓度测量三次，反应结束后，记录不同浓度Fe2+标准溶液到达最大发光值所用时间以及不同浓度Fe2+标准溶液到达最大发光值时的累计发光数，并绘制标准曲线；第三步，取待测含氧化亚铁硫杆菌的菌液接种到9K液体培养基中，测定待测菌液中Fe2+的含量，记录到达最大发光值所用时间与到达最大发光值时累计发光数，代入到标准曲线中求得待测菌液中的Fe2+浓度；第四步，通过公式：Fe2+氧化速率=（CFe2+初始－CFe2+剩余）/CFe2+初始×100%计算氧化亚铁硫杆菌的活性。第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法，其特征在于：包括如下步骤：第一步，调整发光仪参数：高压1000V，标准光源14C每秒发光值为1500 count/s，背景值6count/s，测量温度30℃；第二步，分别配制浓度为1μg/L、10μg/L、30μg/L、50μg/L、70μg/L、80μg/L、100μg/L的Fe2+标准溶液待用，在样品杯中依次加入鲁米诺分析溶液与H2O2溶液，放入发光仪中开始计时，在第20s时从暗室顶端注射孔中将Fe2+标准溶液快速注射入样品室，得到反应体系，每种浓度测量三次；反应结束后，记录不同浓度Fe2+标准溶液到达最大发光值所用时间以及不同浓度Fe2+标准溶液到达最大发光值时的累计发光数，并绘制标准曲线；第三步，取待测含氧化亚铁硫杆菌的菌液接种到9K液体培养基中，测定待测菌液中Fe2+的含量，记录到达最大发光值所用时间与到达最大发光值时的累计发光数，代入到标准曲线中求得待测菌液中的Fe2+浓度；第四步，通过公式：Fe2+氧化速率=（CFe2+初始－CFe2+剩余）/ CFe2+初始×100%计算氧化亚铁硫杆菌的活性。

【技术特征摘要】
1.一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法，其特征在于：包括如下步骤：第一步，调整发光仪参数：高压1000V，标准光源14C每秒发光值为1500count/s，背景值6count/s，测量温度30℃；第二步，分别配制浓度为1μg/L、10μg/L、30μg/L、50μg/L、70μg/L、80μg/L、100μg/L的Fe2+标准溶液待用，在样品杯中依次加入鲁米诺分析溶液与H2O2溶液，放入发光仪中开始计时，在第20s时从暗室顶端注射孔中将Fe2+标准溶液快速注射入样品室，得到反应体系，每种浓度测量三次；反应结束后，记录不同浓度Fe2+标准溶液到达最大发光值所用时间以及不同浓度Fe2+标准溶液到达最大发光值时的累计发光数，并绘制标准曲线；第三步，取待测含氧化...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿红，卓思棋，张辰，宋立博，杨中航，董川，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14