【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于有机小分子荧光探针，具体涉及一种靶向线粒体检测过氧化氢的近红外荧光探针及其应用。
技术介绍
1、过氧化氢(h2o2)作为活性氧(ros)的重要成员，影响着生物体的生长发育。h2o2在生理上可调节生物活性，被广泛认为是衰老和疾病中氧化应激的标志物，也是病原体入侵时免疫反应的防御剂。此外，h2o2作为化学第二信使参与多种生命过程，如细胞增殖、分化、迁移和凋亡。
2、在活细胞中，h2o2的释放和分解受到精准调控。当受到外源刺激时，h2o2的异常生成会诱导氧化应激的发生，攻击细胞生物分子。已有研究表明，h2o2的过量产生和积累与炎症、癌症、糖尿病、神经退行性疾病和心血管疾病密切相关。在细胞器水平上，线粒体是h2o2的主要产生场所和消耗氧气的主要细胞器，因此，线粒体中h2o2的可视化监测对某些疾病的病理研究具有重要意义。
3、小分子荧光探针具有灵敏度高、选择性好、反应快、操作简单、无创检测、实时、原位成像的优点，已被广泛应用于生物活性分子的可视化监测。迄今为止，已经报道了多种荧光探针用于生物系统中h2o2的检测。检测机制主要包括硼酸/苯酚氧化、baeyervilliger氧化重排、串联式payne/dakin反应和碳-碳双键裂解。大多数响应机制都是基于氧化的，极易受到其他ros的干扰。然而，基于水解反应，五氟苯磺酰基实现了对h2o2的特异性识别。一般而言，近红外(nir，650-1700nm)发射荧光探针，由于其光损伤小、穿透深度深、可忽略内源性生物分子的自发荧光干扰，更适合于体内成像。除此之外，线粒
4、此外，由于疾病模型有限，无法深入研究h2o2与线粒体相关疾病的内在关系，如pm2.5暴露诱导的肺损伤、肝缺血再灌注损伤(hiri)、非酒精性脂肪肝(nafl)、肝纤维化(hf)、恶性肿瘤模型等。
5、因此，开发一种新型线粒体靶向荧光探针，采用对h2o2特异性更强的识别基团五氟苯磺酰基，有效避免其他ros的氧化干扰，对于多种相关疾病的可视化诊断是非常必要的。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术提供了一种吸收和发射均在近红外区的、具线粒体靶向能力且能特异性检测h2o2的荧光探针(hcy-h2o2)，它是通过在半菁骨架(hcy-oh)上引入五氟苯磺酰基团构建而成。
2、本专利技术荧光探针hcy-h2o2首次对环境pm2.5暴露诱导的肺损伤模型和肝损伤(包括hiri、nafl和hf)模型中线粒体h2o2的水平异常完成了可视化成像。同时，不仅在癌细胞/组织/肿瘤小鼠中，而且在肿瘤患者的手术标本中也观察到了线粒体内h2o2水平的异常，由此表明，hcy-h2o2在人类临床癌症诊断中具有很大的应用潜力。
3、为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现：
4、一种靶向线粒体检测过氧化氢的荧光探针hcy-h2o2，其结构式为：
5、
6、一种如上所述的荧光探针hcy-h2o2的制备方法，包括以下步骤：
7、(1)将溶解于二氯甲烷中的三氯氧磷逐滴加入n,n-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合液中，冰浴，再加入环己酮，回流，冷却，静置过夜，再过滤干燥，得到黄色固体，即化合物1((e)-2-氯-3-(羟甲烯基)环己烯-1-甲醛)；
8、(2)将2,3,3-三甲基-3h-吲哚和碘乙烷混合，加热回流，冷却至室温后过滤，将过滤出的沉淀物用正己烷洗涤，得到粉红色结晶，即化合物2(1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚碘鎓)；
9、(3)将化合物1((e)-2-氯-3-(羟甲烯基)环己烯-1-甲醛)和化合物2(1-乙基-2,3,3-三甲基吲哚碘鎓)溶于正丁醇和甲苯，加热回流，减压除去溶剂，纯化得到绿色固体，即化合物3(2-((e)-2-(e)2-氯-3-(2-((z)-1-乙基-3,3-二甲基吲哚-2-亚基)亚乙基)环己-1-烯-1-基)乙烯基)-1-乙基-3,3-二甲基-3h-吲哚-1-碘)；
10、(4)在氮气中，将溶于n,n-二甲基甲酰胺的化合物3逐滴加入4-氯苯-1,3-二醇、三乙胺和n,n-二甲基甲酰胺的混合溶液中，加热搅拌，减压除去溶剂，纯化得到蓝色固体，即化合物hcy-oh；
11、(5)将化合物hcy-oh和2,3,4,5,6-五氟苯磺酰氯溶于二氯甲烷，加入三甲胺，室温搅拌，减压除去溶剂，纯化得到紫黑色固体，即探针hcy-h2o2。
12、上述化合物1，2，3和hcy-oh的制备过程参考具有类似结构的现有技术，参考文献为acs appl.mater.interfaces,2017,9,6796-6803。
13、进一步地，步骤(5)中所述hcy-oh和2,3,4,5,6-五氟苯磺酰氯的摩尔比为1:2。
14、进一步地，步骤(5)中所述纯化方法为柱层析，采用二氯甲烷/甲醇作混合溶剂，体积比为200:1-20:1。
15、一种如上所述的荧光探针hcy-h2o2在检测过氧化氢中的应用。
16、进一步地，上述荧光探针hcy-h2o2用于实时监测细胞线粒体自噬过程。
17、进一步地，上述荧光探针hcy-h2o2用于制备肺损伤检测试剂。
18、进一步地，上述荧光探针hcy-h2o2用于制备肝损伤检测试剂。
19、进一步地，上述荧光探针hcy-h2o2用于制备肿瘤检测试剂。
20、本专利技术原理如下：吲哚阳离子与线粒体内负膜电位通过静电作用相结合，使探针靶向于线粒体中，同时利用五氟苯磺酰基作为h2o2的识别单元，使中间体hcy-oh释放；而被五氟苯磺酰基强吸电子能力抑制的分子内电荷转移(ict)过程得到恢复，故产生强烈的近红外荧光信号。
21、本专利技术荧光探针hcy-h2o2具有检测h2o2的特性，探针在近红外(720nm)处的荧光强度随h2o2水平升高而逐渐增强。
22、本专利技术荧光探针hcy-h2o2制备反应式如下：
23、
24、与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
25、(1)本专利技术所述的靶向线粒体检测h2o2的近红外荧光探针，通过乙烯基桥联氧杂蒽(电子供体，d)和吲哚阳离子(电子受体，a)，形成了典型的d-π-a分子构型。
26、(2)本专利技术探针对h2o2变化的识别原理：h2o2与探针的2，3，4，5，6-五氟苯磺酰基团反应，使得中间体hcy-oh释放，发出强荧光，易于识别。
27、(3)本专利技术探针对h2o2变化的检测：探针在乙腈(ch3cn)和磷酸盐缓冲溶液(pbs)的混合体系中，随着h2o2浓度的增加，720nm处荧光显著增强；对h2o2的检测线性范围为0-200μm(r2＝0.9904)，检测限为0.53μm，即探针能够实现对h2o2的高灵敏响应。...
【技术保护点】
1.一种靶向线粒体检测过氧化氢的荧光探针HCy-H2O2，其特征在于，其结构式为：
2.一种如权利要求1所述的荧光探针HCy-H2O2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的荧光探针HCy-H2O2的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述HCy-OH和2,3,4,5,6-五氟苯磺酰氯的摩尔比为1:2。
4.根据权利要求2所述的荧光探针HCy-H2O2的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述纯化方法为柱层析，采用二氯甲烷/甲醇作混合溶剂，体积比为200:1-20:1。
5.一种如权利要求1所述的荧光探针HCy-H2O2在检测过氧化氢中的应用。
6.一种如权利要求5所述的荧光探针HCy-H2O2的应用，其特征在于，用于实时监测细胞线粒体自噬过程。
7.一种如权利要求5所述的荧光探针HCy-H2O2的应用，其特征在于，用于制备肺损伤检测试剂。
8.一种如权利要求5所述的荧光探针HCy-H2O2的应用，其特征在于，用于制备肝损伤检测试剂。
9.一种如权利要求5所述的荧光
...【技术特征摘要】
1.一种靶向线粒体检测过氧化氢的荧光探针hcy-h2o2，其特征在于，其结构式为：
2.一种如权利要求1所述的荧光探针hcy-h2o2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的荧光探针hcy-h2o2的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述hcy-oh和2,3,4,5,6-五氟苯磺酰氯的摩尔比为1:2。
4.根据权利要求2所述的荧光探针hcy-h2o2的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述纯化方法为柱层析，采用二氯甲烷/甲醇作混合溶剂，体积比为200:1-20:1...
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