脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途制造技术

本发明专利技术提出了脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途。脐动脉内皮细胞能够为造血干细胞构建微环境，支持造血干细胞的体外扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。

【技术实现步骤摘要】
脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途
本专利技术涉及生物领域。具体地，本专利技术涉及脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途。更具体地，本专利技术涉及脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途、重组细胞及其制备方法、造血干细胞扩增的方法、培养基、饲养层细胞和试剂盒。
技术介绍
造血干细胞(hematopoieticstemcell，HSC)具有高度的自我更新能力以及多向分化潜能，可以产生所有类型的血液细胞，如红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞等。它在生命过程中不仅能够重建整个造血系统，还具备维持长期造血的功能。近年来，HSC移植越来越多地被应用于临床治疗血液或非血液系统的恶性肿瘤，显示出广阔的应用前景。其中，尤以脐带血移植(umbilicalcordbloodtransplantation，UCBT)备受青睐，它具有来源广泛、易于采集、对供体无伤害、HLA配型要求低、移植后复发率及移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)的发病率较低等优点。然而，单份脐带血中HSC绝对数量较少，输注后容易导致中性粒细胞恢复延迟并增加细菌及病毒感染的风险，而双份脐带血移植则会带来移植物抗宿主病发病率增加、血小板恢复时间延长等一系列问题。综合来看，对HSCs进行体外扩增培养是最直接便捷的解决方法，但迄今为止构建适宜的HSC体外扩增微环境仍是亟待解决的瓶颈问题。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：1978年Schofield首次提出了干细胞龛(Niche)的概念，指出特异性的微环境(Microenvironment)会对干细胞功能产生作用，随后有大量文献证实了多种组织中干细胞龛的存在。人们曾尝试多种方式来模拟体内造血微环境，以期望构建维持造血干细胞(HSCs)自我更新与扩增的体外培养体系，如造血相关的细胞因子、小分子、基质细胞共培养、Notch配体等，但效果仍然差强人意。HSCs最早出现的位点是几个主要的动脉，包括AGM区的主动脉弓、头部动脉、卵黄动脉以及脐动脉，这是孕育HSCs产生以及维持其自我更新的重要场所。引起专利技术人注意的是分娩后脐带中仍然有大量HSCs存在，这其中极有可能蕴涵着维持HSCs干性的重要因素。在AGM区、骨髓等位点均已证实内皮细胞(ECs)是造血微环境的重要核心组份，分泌多种造血相关因子。此外，HSCs起源于动脉内的生血内皮(HE)，且与ECs共表达许多表面标志和转录因子。因此，专利技术人推测，脐带中的动脉内皮细胞(HuAECs)有可能也是影响HSCs的重要微环境因素之一，利用这一微环境构建新的培养平台，可以支持HSCs的体外扩增，同时维持HSCs的自我更新。有鉴于此，专利技术人采用脐动脉内皮细胞作为饲养层细胞，以构建造血干细胞微环境，维持造血干细胞扩增。进一步地，专利技术人发现，由于脐动脉内皮细胞的存活依赖于血清和血管内皮细胞生长因子，但在体外共培养环境中血清和血管内皮相关因子又会抑制脐动脉内皮细胞的分泌功能、成血管活性以及对造血稳态的支持作用，且会干扰HSCs的扩增。E4orf1是腺病毒E4编码区的基因产物，能够调控细胞信号通路进而影响细胞周期和细胞凋亡。专利技术人发现，将E4orf1基因导入脐动脉内皮细胞，能够使得脐动脉内皮细胞在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下存活且维持自身特性，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态。从而，为造血干细胞构建微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。为此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途。专利技术人发现，脐动脉内皮细胞能够为造血干细胞构建微环境，支持造血干细胞的体外扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。根据本专利技术的实施例，所述用途还可以具有下列附加技术特征：根据本专利技术的实施例，所述脐动脉内皮细胞是以重组细胞的形式提供的，所述重组细胞携带有E4orf1基因以及任选的GFP基因。根据本专利技术的实施例，所述脐动脉内皮细胞用作饲养层细胞。根据本专利技术的实施例，所述脐动脉内皮细胞用于维持造血干细胞扩增。根据本专利技术的实施例，所述脐动脉内皮细胞的血管内皮生长因子受体KDR的表达率为90～95％，内皮细胞标志CD144的表达率均大于99％，内皮细胞标志CD31的表达率为90～95％，干性标志CD117、内皮祖细胞标志CD133以及造血细胞CD45的表达率均低于0.4％。根据本专利技术的实施例，所述脐动脉内皮细胞高表达Notch4基因、DLL4基因和Cxcr4基因。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种重组细胞。根据本专利技术的实施例，所述重组细胞为携带有E4orf1基因的脐动脉内皮细胞。专利技术人发现，由于脐动脉内皮细胞的存活依赖于血清和血管内皮细胞生长因子，但在体外共培养环境中血清和血管内皮相关因子又会抑制脐动脉内皮细胞的分泌功能、成血管活性以及对造血稳态的支持作用，且会干扰HSCs的扩增。进一步地，专利技术人经深入研究发现，将E4orf1基因导入脐动脉内皮细胞，使得脐动脉内皮细胞可以在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下存活且维持自身特性，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态，从而构建促进造血干细胞体外扩增的微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。根据本专利技术的实施例，所述脐动脉内皮细胞携带有GFP基因。根据本专利技术的实施例，所述重组细胞用于维持造血干细胞扩增。根据本专利技术的实施例，所述重组细胞的血管内皮生长因子受体KDR的表达率为90～95％，内皮细胞标志CD144的表达率均大于99％，内皮细胞标志CD31的表达率为90～95％，干性标志CD117、内皮祖细胞标志CD133以及造血细胞CD45的表达率均低于0.4％。根据本专利技术的实施例，所述重组细胞为饲养层细胞。根据本专利技术的实施例，所述重组细胞高表达Notch4基因、DLL4基因和Cxcr4基因。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种制备前面所述重组细胞的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将携带有E4orf1基因的第一载体加入含有所述脐动脉内皮细胞的第一培养基中，进行培养，以便得到所述重组细胞。由此，根据本专利技术实施例的重组细胞能够为造血干细胞构建微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。根据本专利技术的实施例，所述方法进一步包括：分别将所述第一载体和携带有GFP基因的第二载体共同加入所述脐动脉内皮细胞的培养基中。根据本专利技术的实施例，所述第一载体为包装有质粒MSCV-NE4orf1的逆转录病毒，并且所述质粒上携带有抗嘌呤霉素基因。根据本专利技术的实施例，所述第二载体为包装有质粒pMX-GFP的逆转录病毒，并且所述质粒上携带有抗嘌呤霉素基因。根据本专利技术的实施例，所述第一载体和第二载体的体积比为1:1。根据本专利技术的实施例，所述第一培养基包括EGM-2基础培养基和0.5μg/ml的嘌呤霉素，且不含有血清及血管内皮细胞生长因子。根据本专利技术的实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途。

【技术特征摘要】
1.脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脐动脉内皮细胞是以重组细胞的形式提供的，所述重组细胞携带有E4orf1基因以及任选的GFP基因；任选地，所述脐动脉内皮细胞用作饲养层细胞；任选地，所述脐动脉内皮细胞用于维持造血干细胞扩增；任选地，所述脐动脉内皮细胞的血管内皮生长因子受体KDR的表达率为90～95％，内皮细胞标志CD144的表达率均大于99％，内皮细胞标志CD31的表达率为90～95％，干性标志CD117、内皮祖细胞标志CD133以及造血细胞CD45的表达率均低于0.4％；任选地，所述脐动脉内皮细胞高表达Notch4基因、DLL4基因和Cxcr4基因。3.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为携带有E4orf1基因的脐动脉内皮细胞。4.根据权利要求3所述的重组细胞，其特征在于，所述脐动脉内皮细胞携带有GFP基因；任选地，所述重组细胞用于维持造血干细胞扩增；任选地，所述重组细胞的血管内皮生长因子受体KDR的表达率为90～95％，内皮细胞标志CD144的表达率均大于99％，内皮细胞标志CD31的表达率为90～95％，干性标志CD117、内皮祖细胞标志CD133以及造血细胞CD45的表达率均低于0.4％；任选地，所述重组细胞为饲养层细胞；任选地，所述重组细胞高表达Notch4基因、DLL4基因和Cxcr4基因。5.一种制备权利要求3或4所述重组细胞的方法，其特征在于，包括：将携带有E4orf1基因的第一载体加入含有所述脐动脉内皮细胞的第一培养基中，进行培...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴雪涛，裴海云，岳文，李慧琳，王思涵，谢小燕，韩毅，白云，范增，张博文，南雪，何丽娟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11