一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂制造技术

本发明专利技术公开了一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂。本发明专利技术保护的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030，其保藏编号为：CGMCC No.12415。其胞外多糖能显著增强小鼠骨髓来源树突状细胞分泌细胞因子。将胞外多糖与OVA抗原免疫小鼠，可以显著提高小鼠血清中OVA特异性IgG抗体以及IgG抗体亚类的滴度；胞外多糖还能显著促进脾脏T淋巴细胞增殖以及INF‑γ和IL‑4的分泌；显著提高脾脏IL‑4

【技术实现步骤摘要】
一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂
本专利技术涉及一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂。
技术介绍
疫苗是防控传染病的核心制品,在预防和控制动物传染病,保障人类健康、畜牧业和农业的可持续发展中起着重要的作用。尽管在疫苗开发制备等方面做出了很多努力，但目前部分疫苗的免疫效果并不理想，要克服现有疫苗引起的免疫应答效应单一，免疫原性弱的缺点，需辅于更为有效的免疫佐剂来增强疫苗的免疫应答。佐剂应用于疫苗中，能够提高抗原的免疫原性，增强疫苗的效果，降低抗原的使用量，使疫苗在价格上具有明显优势。因此，研发新型安全、有效的疫苗佐剂来激发机体产生高效的天然和获得性免疫应答，提升体液和细胞免疫应答水平，丰富疫苗的免疫应答类型，充分发挥出疫苗的免疫保护作用，是未来新型免疫佐剂研发的重要发展方向。铝佐剂自1926年发现以来，至今已有80多年的历史，是至今唯一通过FDA批准的能用于人的佐剂。但随着疫苗研发品种的增加，发现其使用存在一定的局限性，且会存在一定的副作用，远远不能满足新型疫苗佐剂的要求。理想的新型免疫佐剂应该是对动物机体的细胞或体液免疫均有有效的激发作用、作用持久稳定、免疫次数减少、副作用小,同时便于生产和易于注射。多糖是细胞与细胞间相互作用中重要的信号分子，在激活和调节先天性和适应性免疫反应中起到重要的作用。越来越多的研究证明多糖是一种良好的免疫增强剂。。乳酸菌胞外多糖(LABEPS)是乳酸菌在其生长和代谢过程中所分泌到细胞外的一种多糖类化合物。乳酸菌通常被认为是食品安全级(GRAS)微生物，因此，它们所产的EPS同样也被认为是安全无毒的，备受广大研究者们的青睐。研究表明,乳酸菌胞外多糖对免疫系统发挥多方面的重要调节作用，而且安全无毒，成为安全高效新型疫苗佐剂的候选资源。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂。本专利技术提供的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030，已于2016年05月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNo.12415。本专利技术还保护干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030或其培养物在制备胞外多糖中的应用。本专利技术还保护酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030的胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：培养干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030，得到胞外多糖。所述方法中，采用MRS液体培养基培养干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030。所述方法中，所述培养的温度为37℃；所述培养的时间为30h；所述培养为静置培养。所述方法还包括如下步骤：(1)采用三氯乙酸萃取所述培养得到的发酵液，收集上清液；(2)用乙醇沉淀步骤(1)得到的上清液，收集沉淀；(3)将步骤(2)得到的沉淀溶解后进行透析，收集分子量为8K～12KDa的物质，冷冻干燥。所述方法还包括如下步骤：完成步骤(3)后，对冷冻干燥得到的粗多糖进行离子交换纯化和分子筛纯化，得到胞外多糖。本专利技术还保护以上任一所述的方法制备得到的胞外多糖。本专利技术还保护干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030或其发酵物在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a7)中的至少一种：(a1)作为免疫佐剂；(a2)提高疫苗的免疫效果；(a3)提高疫苗诱发的特异性抗体含量；(a4)促进TNF-α和/或IL-6和/或IL-10和/或IL-12和/或INF-γ和/或IL-4分泌；(a5)促进淋巴细胞增殖；(a6)提高脾脏IL-4+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD8+T细胞的数量；(a7)作为免疫促进剂。本专利技术还保护以上任一所述胞外多糖在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a7)中的至少一种：(a1)作为免疫佐剂；(a2)提高疫苗的免疫效果；(a3)提高疫苗诱发的特异性抗体含量；(a4)促进TNF-α和/或IL-6和/或IL-10和/或IL-12和/或INF-γ和/或IL-4分泌；(a5)促进淋巴细胞增殖；(a6)提高脾脏IL-4+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD8+T细胞的数量；(a7)作为免疫促进剂。本专利技术还保护一种产品，包括以上任一所述胞外多糖；所述产品的用途为如下(a1)-(a6)中的至少一种：(a1)作为免疫佐剂；(a2)提高疫苗的免疫效果；(a3)提高疫苗诱发的特异性抗体含量；(a4)促进TNF-α和/或IL-6和/或IL-10和/或IL-12和/或INF-γ和/或IL-4分泌；(a5)促进淋巴细胞增殖；(a6)提高脾脏IL-4+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD4+T细胞和/或IFN-γ+CD8+T细胞的数量。以上任一所述(a5)中，所述淋巴细胞具体可为脾脏T淋巴细胞。本专利技术还保护一种产品，包括所述的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030和疫苗。以上任一所述疫苗为口蹄疫疫苗，具体可为口蹄疫疫苗146S。本专利技术的专利技术人从实验室保存鉴定的110株乳酸杆菌所产EPS进行测定，筛选1株能够提高机体特异性免疫应答的乳酸菌胞外多糖(LactobacilluscaseiWXD030EPS)，该多糖能显著增强小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)分泌细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12)。将WXD030EPS与OVA抗原免疫小鼠，发现WXD030EPS可以显著提高小鼠血清中OVA特异性IgG抗体以及IgG抗体亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的滴度，与铝盐(Alum)佐剂相比，差异显著；WXD030EPS还能显著促进脾脏T淋巴细胞增殖以及INF-γ和IL-4的分泌；显著提高脾脏IL-4+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞以及IFN-γ+CD8+T细胞的比例；此外，WXD030EPS还可以显著增强口蹄疫灭活疫苗在小鼠上诱发的特异性抗体滴度。附图说明图1为WXD030EPS经过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱得到的洗脱曲线。图2为WXD030EPS经SepharoseCL-6B色谱柱洗脱曲线。图3为WXD030EPS的紫外扫描结果。图4为WXD030EPS的红外光谱扫描结果。图5为WXD030EPS的相对分子质量分布图谱。图6为WXD030EPS的离子色谱图。图7为WXD030EPS对小鼠BMDCs分泌细胞因子的影响。A：WXD030EPS刺激小鼠BMDCs后分泌TNF-α的结果；B：WXD030EPS刺激小鼠BMDCs后分泌IL-6的结果；C：WXD030EPS刺激小鼠BMDCs后分泌IL-10的结果；D：WXD030EPS刺激小鼠BMDCs后分泌IL-12的结果。与PBS组比较，＊：p＜0.05，＊＊：p＜0.01，＊＊＊：p＜0.001。n＝3。图8为WXD030EPS对小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及其亚类水平的影响。A:首免14天小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及其亚类水平；B:二免14天后小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及其亚类水平。与O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WXD030，其保藏编号为：CGMCC No.12415。

【技术特征摘要】
1.干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030，其保藏编号为：CGMCCNo.12415。2.权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030或其培养物在制备胞外多糖中的应用。3.干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030的胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030，得到胞外多糖。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：采用MRS液体培养基培养干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030。5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为37℃；所述培养的时间为30h；所述培养为静置培养。6.权利要求3至5任一所述的方法制备得到的胞外多糖。7.权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)WXD030或其发酵物在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a7)中的至少一种：(a1)作为免疫佐剂；(a2)提高疫苗的免疫效果；(a3)提高疫苗诱发的特异性抗体含量；(a4)促进TNF-α和/或IL-6和/或IL-10和/或IL-12和/或INF-γ和/或IL-4分泌；(a5)促进淋巴细胞增殖；(a6)提...

【专利技术属性】
技术研发人员：王潇，修磊，杜瑞平，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15