一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法及该菌种的应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法及该菌种的应用。本发明专利技术以蟹下脚料作为唯一底物，将未知菌液与蟹下脚料一同发酵培养，将蟹下脚料发酵液稀释后涂布到无菌培养基上培养，观察培养后的菌落的形态，选取菌落数量最多的三种形态的菌落，将挑选出的三种菌落分别划线到无菌培养基中进行分离纯化，纯化得到的三种菌株便为降解蟹下脚料的优势菌株。本发明专利技术通对未知组成成分的混合菌液进行特定菌种的筛选，分离筛选出能高效利用下脚料废物的优势菌种。通过本发明专利技术的方法能够将蟹下脚料废弃物再利用，提取其中的营养物质，避免浪费，同时也避免了环境污染。

【技术实现步骤摘要】
一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法及该菌种的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法及该菌种的应用。
技术介绍
海产品内脏是指在海产品加工过程中产生的废料，以及一些边角料，但所含营养成分极其丰富。蟹种类繁多，数量丰富，多被制成肉罐头，肉酱、蟹黄酱、调味油、蟹味调料等食品。在制作蟹类产品时，会随即产生大量的废弃物。但这些废弃物中所含营养却相当丰富，其中含20～40％的蛋白质、20～30％的甲壳质、2.7％的脂肪，同时还含有钙盐等矿物质及色素。若不将这些资源进行回收利用，则是对自然资源的一种严重浪费，也是对环境的污染和破坏。中国专利申请公开号为CN104938604B的专利，公开了一种水产加工下脚料综合利用方法。该方法是以鱼、虾、蟹等甲壳动物加工下脚料为原料，通过清洗、低温干燥、冷冻粉碎、复合酶降解、有机酸提取、离心分离、反渗透脱水、分子包埋、高压均质、真空低温冷冻式干燥、制粒、压片、自动瓶装包装生产线、外包装等全套工艺，将水产加工下脚料中所有高附加值的生物活性成分——虾青素、蛋白质、有机钙和甲壳素及其衍生物壳聚糖等一并提取出来。但该方法操作复杂，用水量大，浪费水资源。同时，该专利技术中的地下无动力生态污水处理系统深埋在地底深处，施工难度大。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法及该菌种的应用。本专利技术对蟹下脚料废弃物进行再加工，结合微生物发酵作用，对其回收，提取其营养物质。本专利技术以蟹下脚料作为唯一底物，对未知组成成分的混合菌液进行特定菌种的筛选，分离筛选出能高效利用下脚料废物的优势菌种。能够将蟹下脚料废弃物再利用，提取其中的营养物质，避免浪费，同时也避免了环境污染。本专利技术的具体技术方案为：一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法，包括以下步骤：(1)无菌环境下，将无菌的蟹下脚料、无菌水和混合菌液一起发酵培养，得蟹下脚料发酵液；(2)无菌条件下，将蟹下脚料发酵液用无菌水进行梯度稀释，将稀释后的蟹下脚料发酵液涂布在无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；(3)无菌条件下，挑取数量最多的三种不同形态的菌落，依次命名为X1、X2、X3，每种形态的单菌落分别划线在不同的无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；(4)无菌条件下，将经步骤(3)培养的分别划线有X1、X2、X3的培养基中X1、X2、X3的单菌落再次划线到无菌培养基中培养；重复划线至少3次，最后得到的菌种即为分离纯化后的菌种X1、X2、X3。本专利技术以蟹下脚料作为唯一底物，将未知菌液与蟹下脚料一同发酵培养，将蟹下脚料发酵液稀释后涂布到无菌培养基上培养，观察培养后的菌落的形态，选取菌落数量最多的三种形态的菌落，将挑选出的三种菌落分别划线到无菌培养基中进行分离纯化，纯化得到的三种菌株便为降解蟹下脚料的优势菌株。本专利技术通对未知组成成分的混合菌液进行特定菌种的筛选，分离筛选出能高效利用下脚料废物的优势菌种。通过本专利技术的方法能够将蟹下脚料废弃物再利用，提取其中的营养物质，避免浪费，同时也避免了环境污染。作为优选，步骤(2)中，所述蟹下脚料、无菌水的料水比为1:3～9，混合菌液的添加量为蟹下脚料悬液体积的8～30％。作为优选，所述混合菌液的添加量为蟹下脚料悬液体积的8～15％。专利技术人经过大量的实验发现，当混合菌液的添加量为蟹下脚料悬液体积的8～15％时，发酵培养的效果最好。由于蟹下脚料含有较多的钙盐等矿物质，质地较硬，发酵培养时增加混合菌液的量，加快蟹下脚料的降解。当混合菌液的量过少时，发酵速度慢，降解不完全。当混合菌液的量过多时，会导致菌液在短时间内达到平稳期，进而很快进入衰退期，导致菌落数量减少，也不利于发酵的进行。专利技术人经过大量的实验发现，当混合菌液的添加量为蟹下脚料悬液体积的8～30％时，可以达到良好的发酵，当混合菌液的添加量为蟹下脚料悬液体积的8～15％时，发酵培养的效果最好。作为优选，所述混合菌液中的菌群包括光合菌群、酵母菌群、革兰氏阳性放线菌群和发酵系的丝状菌群，混合菌液的质量百分浓度为1～3％。混合菌液为商业的包含光合菌群、酵母菌群、革兰氏阳性放线菌群和发酵系的丝状菌群的菌液，其与蟹下脚料一同发酵时必然存在某几种发酵蟹下脚料的优势菌落，将其分离纯化可得到能高效降解蟹下脚料的优势菌落。由于蟹壳质硬，不易降解，需要增大混合菌液的浓度，以达到快速降解的目的。当混合菌液的浓度为1～3wt％时，混合菌液与蟹下脚料一同发酵的蟹下脚料发酵液中的不同形态的菌落容易区分，容易挑选出优势的菌落。当混合菌液的浓度过高时，蟹下脚料发酵液中不同形态的菌落不容易区分，优势菌株的分离纯化困难。当混合菌液的浓度过低时，蟹下脚料不能被有效的降解，发酵时间过长。作为优选，步骤(2)中，所述发酵培养的温度为27～35℃，摇床转速为110～140r/min，培养时间为20～50h。作为优选，步骤(3)中所述稀释后的蟹下脚料发酵液为三个梯度，分别为梯度稀释前浓度的10-4、10-5、10-6倍的蟹下脚料发酵液，所述培养的条件与步骤(2)中培养的条件相同。作为优选，步骤(3)、(4)、(5)中，所述的无菌培养基为购于青岛海博生物技术有限公司的营养琼脂培养基经121℃灭菌40min得到的。作为优选，对步骤(5)中所述的分离纯化后的菌株X1、X2、X3进行鉴定，鉴定方法为：将分离纯化后的菌株X1、X2、X3分别划线到营养肉汤固体培养基平板上，将营养肉汤固体培养基平板上长出来的菌落进行革兰氏染色后在显微镜下观察菌落形态；同时，经过细菌基因组提取、特异引物扩增16SrDNA序列、纯化PCR产物、DNA测序获得X1、X2、X3的16SrDNA序列，得到的X1、X2、X3的16SrDNA序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示。菌株X1的16SrDNA核苷酸序列为：CCCTCTAGATGCATGCTCGAGGGAGAGTTTGATCAGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGAGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGGCGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）无菌环境下，将无菌的蟹下脚料、无菌水和混合菌液一起发酵培养，得蟹下脚料发酵液；（2）无菌条件下，将蟹下脚料发酵液用无菌水进行梯度稀释，将稀释后的蟹下脚料发酵液涂布在无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；（3）无菌条件下，挑取数量最多的三种不同形态的菌落，依次命名为X1、X2、X3，每种形态的单菌落分别划线在不同的无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；（4）无菌条件下，将经步骤（3）培养的分别划线有X1、X2、X3的培养基中X1、X2、X3的单菌落再次划线到无菌培养基中培养；重复划线至少3次，最后得到的菌种即为分离纯化后的菌种X1、X2、X3。

【技术特征摘要】
1.一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）无菌环境下，将无菌的蟹下脚料、无菌水和混合菌液一起发酵培养，得蟹下脚料发酵液；（2）无菌条件下，将蟹下脚料发酵液用无菌水进行梯度稀释，将稀释后的蟹下脚料发酵液涂布在无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；（3）无菌条件下，挑取数量最多的三种不同形态的菌落，依次命名为X1、X2、X3，每种形态的单菌落分别划线在不同的无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；（4）无菌条件下，将经步骤（3）培养的分别划线有X1、X2、X3的培养基中X1、X2、X3的单菌落再次划线到无菌培养基中培养；重复划线至少3次，最后得到的菌种即为分离纯化后的菌种X1、X2、X3。2.如权利要求1所述的一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述蟹下脚料、无菌水的料水比为1:3~9，混合菌液的添加量为蟹下脚料悬液体积的8~30%。3.如权利要求2所述的一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法，其特征在于：所述混合菌液的添加量为蟹下脚料悬液体积的8~15%。4.如权利要求3所述的一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法，其特征在于：所述混合菌液中的菌群包括光合菌群、酵母菌群、革兰氏阳性放线菌群和发酵系的丝状菌群，混合菌液的质量百分浓度为1~3%。5.如权利要求1所述的一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述发酵培养的温度为27~35℃，摇床转速为110~140r/min，培养时间为20~50h。6.如权利要求1所述的一种利用蟹下脚料筛选菌种的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述稀释后的蟹下脚料发酵液为三个梯度，分别为梯度稀释前浓度的10-4、10-5、10-6倍的蟹下脚料发酵液，所述培养的条件与步骤（2）中培养的条件相同。7.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：闻正顺，李怡，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33