PITX2基因用于筛选伊犁马泌乳性状试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了PITX2基因用于筛选伊犁马泌乳性状试剂盒及其应用，利用本发明专利技术检测试剂盒通过检测AA、AB和BB等位基因，用于选育提高伊犁马泌乳性状，本发明专利技术根据利用伊犁马PITX2基因的DNA序列自行人工设计特异性引物，以样本基因组DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物后进行SSCP检测；本发明专利技术的建立，在为选育泌乳性状优良的伊犁马品种，提供分子辅助育种的理论基础和技术支持的同时，对于保护伊犁马的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快乳用马发展具有实际应用价值。

A Kit for Screening Lactation Traits of Ili Horse Using PITX2 Gene and Its Application

The invention discloses a PITX2 gene kit for screening the lactation traits of Ili horses and its application. The detection kit of the invention is used for breeding and improving the lactation traits of Ili horses by detecting AA, AB and BB alleles. According to the DNA sequence of the PITX2 gene of Ili horses, the specific primers are designed artificially, the sample genomic DNA is used as template for PCR amplification, and the PCR amplification production is carried out. The invention provides the theoretical basis and technical support for molecular assisted breeding of Ili horse breeds with excellent lactation characteristics, and has practical application value for protecting the excellent variety resources of Ili horse, improving the economic income of farmers and herdsmen, and accelerating the development of dairy horses.

【技术实现步骤摘要】
PITX2基因用于筛选伊犁马泌乳性状试剂盒及其应用
专利技术涉及动物遗传选育的鉴定方法，具体的，本专利技术涉及一种伊犁马泌乳性状筛选的试剂盒的

技术介绍
马奶不仅具有较高的营养价值，容易被人体消化吸收，且马奶中各营养成分比例接近人奶，可作为母乳的替代品之一。马奶因其独特的成分自古以来就成为一种医疗用品和滋补营养品。马奶中富含许多免疫活性物质和抗癌物质具有较广泛的药用价值，可以作为一种免疫促进剂，增强人体免疫功能、延缓衰老，还可预防心血管疾病、神经系统疾病以及胃肠道疾病，同时对结核病有预防和治疗作用。但马奶产量低，同时也缺乏乳用马品种，马奶产量远低于牛奶产量，无法满足人们对马奶等具有医疗、保健作用特殊乳制品的需要。因此，提高马奶产奶性能成为了开发利用马奶的首要任务。单核昔酸多态性(Singlesnuleotidepolmorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核昔酸的变异所引起的序列多态性。表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现形式有转换、颠换、插入和缺失等。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(PCR-single-strandconformationpolyrphism，PCR-SSCP)是近年来应用较为广泛的一种基因多态性检测技术，即应用一技术对控制家畜性状的基因进行分型，联合经济性状的遗传规律进行分析，找到与经济性状相连锁的重要标记基因，做到早期选种、准确选种。通过分子育种，综合改良畜禽重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。随着分子生物学的快速发展，分子标记在家畜育种中的应用日益广泛，其重要性也日益凸现。
技术实现思路
针对现有技术中未见报道专门针对PITX2基因在伊犁马泌乳性状筛选中的SNP标记研究的技术现状，本专利技术旨在为了提供了含PITX2基因用于提高伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，用于选育提高伊犁马泌乳性状。本专利技术提供了一种含PITX2基因用于筛选伊犁马泌乳性状检测试剂盒，所述用于检测PITX2基因的等位基型因包括AA、AB和BB。本专利技术中，等位基因型AA、AB和BB从伊犁马血浆中检测。本专利技术同时提供一种含PITX2基因用于筛选哈萨克马泌乳性状的检测试剂盒，包括盒体，盒体上方与盖体通过活动合页连接，盒体底部设置底板，底板内设有电池板，盒体内由隔板二分为96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR反应试剂区和SSCP分型检测试剂区，采血管区、DNA提取试剂区、PCR反应试剂区和SSCP分型检测试剂区底部均设置抬升机构，抬升机构中，开关两侧设置弹簧柱，弹簧柱顶端高于开关顶端设置，开关下方设置电机，开关和电机间设置定时器，电机输出端向上设置伸缩杆，电机与电池板电性连接。本专利技术中，伸缩杆的数量大于四组。本专利技术中，96孔板区内设置多组隔板一。本专利技术中，盒体一侧设置标签，盒体一侧表面设置透明袋，透明袋内设有说明材料。本专利技术中，盖体上设置把手，盒体与底板通过活动锁和合页连接。本专利技术中，DNA提取试剂区的试剂为蛋白酶K、无水乙醇、缓冲液GB、磁悬浮液B、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱液TB、超纯灭菌水。本专利技术中，PCR反应试剂的试剂为2×MasterMix、上下游引物和灭菌超纯水。本专利技术中，SSCP分型检测试剂区的试剂为变性缓冲液、95％甲酰胺、10mmol/LEDTA、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青、30％丙烯酰胺、5×TBE、TEMED、10％过硫酸铵、0.1％硝酸银染色液、2％氢氧化钠、0.1％甲醛、AA等位基因标记物、AB等位基因标记物、BB等位基因标记物。本专利技术中，96孔板区放置灭菌96孔板。本专利技术中，枪头区放置灭菌枪头。本专利技术中，采血管区放置装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管。本专利技术提供含PITX2基因用于检测伊犁马泌乳性状的试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：(1)引物设计及合成：根据NCBI中公布的马PITX2基因序列(GenBankID：NC009145.2)，自行人工设计特异性引物。(2)PCR反应试剂：Master、上下游引物、DNA模板和ddH2O。优选的，共建体系(1)中所述的特异性引物如下所示：PITX2引物：上游引物F5'-GAGCATTGTCTTCGGTGA-3'；下游引物R5'-CGACTTTACCCCATTCCA-3'。进一步，本专利技术提供含PITX2基因用于筛选哈伊犁马泌乳性状检测试剂盒的应用，通过其检测方法体现，包括以下步骤：(1)伊犁马基因组DNA的提取：利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，活体采集伊犁马颈静脉血5mL，利用以上所述试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存待用。(2)PITX2基因PCR扩增：根据设计的引物，以上所述试剂盒中试剂特异性扩增PITX2基因；PCR反应体系为，由步骤(1)获得的马基因组DNA模板1.0μL，PCRMixture10μL，F、R引物各0.5μL，加ddH2O至总体积为20μL；反应条件为，94℃5min，94℃30s，56.5℃30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃5min；4℃保存。(3)SSCP检测：PCR扩增产物变性，取5μl步骤(2)获得的PCR产物，加入8μl变性缓冲液，95％甲酰胺、10mmol/LEDTA、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青，离心后，在PCR仪中98℃变性10min，取出后立即置于冰上，10min后全部上样于8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上。聚丙烯酰胺凝胶电泳，将适量0.5×TBE缓冲液加入上下槽，预电泳30min后，用微量进样器吸取变性后的PCR产物加入点样孔，电压180V，电流50mA，电泳16h。染色及显色，将凝胶从电泳槽中取出，用蒸馏水漂洗2次后，加入0.1％硝酸银染色液250mL，放于摇床避光轻摇15min，倒出染色液；加入显色液250mL，浸没凝胶，观察，直到凝胶上显现电泳带；倒出显色液，迅速用去离子水冲洗2-3次；用Bio-RAD凝胶成像系统成像，根据条带数量和位置进行基因判型。本专利技术中，显色液按体积百分比2％氢氧化钠和0.1％甲醛混合制成。本专利技术中，非变性聚丙烯酰胺凝胶按体积比30％丙烯酰胺18mL、5×TBE11mL、TEMED36mL、10％过硫酸铵385μL和超纯水25mL混合制成。本专利技术中，伊犁马的PITX2基因特异性引物设计中，通过国际分子生物信息网站NCBI(NationalCenterforBiotechnology)，检索得到马的PITX2基因的DNA序列(GenBankID:NC009145.2)，借助公知软件Primer3.0，自行人工设计特异性引物。通过采用上述提供的技术方案，本专利技术获得以下有益效果：(1)本专利技术中，虽然如上所述，在构建一种用于选育伊犁马泌乳性状的检测试剂盒中，在采用现有技术中PITX2因作为影响家畜泌乳性状候选基因并构建试剂盒，在新疆伊犁马群体中，PITX2基因SNP位点与伊犁马的产奶量相关，存在3种基因型：AA、AB和BB，A为优势等位基因，此位点突变使伊犁马产奶量下降，为选育泌乳性状优良的伊犁马品种，提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。(2)本专利技术通过提供用于选育伊犁马泌乳性状的试剂盒，利用试剂盒对伊犁马的PITX2基因的表达量进行检测，并与伊犁马的日均产奶量(kg/d)进行差异显著性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含PITX2基因的伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测PITX2基因的等位基型因包括AA、AB和BB。

【技术特征摘要】
1.一种含PITX2基因的伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测PITX2基因的等位基型因包括AA、AB和BB。2.如权利要求1所述的含PITX2基因的伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括盒体，盒体上方与盖体通过活动合页连接，盒体底部设置底板，底板内设有电池板，盒体内由隔板二分为96孔板区、枪头区、采血管区、DNA提取试剂区、PCR反应试剂区和SSCP分型检测试剂区，采血管区、DNA提取试剂区、PCR反应试剂区和SSCP分型检测试剂区底部均设置抬升机构，抬升机构中，开关两侧设置弹簧柱，弹簧柱顶端高于开关顶端设置，开关下方设置电机，开关和电机间设置定时器，电机输出端向上设置伸缩杆，电机与电池板电性连接。3.如权利要求2所述的含PITX2基因用于筛选伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中，伸缩杆的数量大于四组。4.如权利要求2所述的含PITX2基因用于筛选伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中，96孔板区内设置多组隔板一。5.如权利要求2所述的含PITX2基因用于筛选伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中，盒体一侧设置标签，盒体一侧表面设置透明袋，透明袋内设有说明书。6.如权利要求2所述的含PITX2基因用于筛选伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中，盖体上设置把手，盒体与底板通过活动锁和合页连接。7.如权利要求1所述的含PITX2基因用于筛选伊犁马泌乳性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒通过以下共建体系建成获得：（1）引物设计及合成：根据NCBI中公布的伊犁马PITX2基因序列（GenBankID：NC009145.2），自行人工设计特异性引物；（2）PCR反应试剂：Master、上下游引物、DNA模板和ddH2O。8.如权利要求7所述含PITX2基因用于筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘武军，于茜，方超，刘玲玲，帕孜拉·肉孜阿洪，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65